单细胞显微注射用于细胞通讯分析

您好，我叫Anael。我在奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会的细胞通讯实验室工作。我们在此研究免疫系统和肝脏背景下P2受体和缝隙连接的功能。

今天，我将向您介绍细胞的显微注射技术。缝隙连接在突触传递、心脏收缩等生理过程中发挥着重要作用。利用该技术，我们可以研究缝隙连接是否具有功能。

好的，让我们来看一下显微注射装置的基本组件。这里我们有一台倒置荧光显微镜，用于观察细胞。这是一台CCD相机，用于记录实验结果。

我们这里有一个电流发生器，将用于把染料注入细胞。接下来是微电极的固定装置，微电极将连接于此。还有一个显微操作器，与固定装置相连，可控制微电极在三个轴向（Z、Y 和 X）上的移动。在开始实验之前，我们必须先制备微电极。

我们使用这种硼硅酸盐玻璃毛细管和名为polar的设备。将硼硅酸盐玻璃毛细管固定在此处。通过加热该钨丝，制备两个微电极。

现在加热钨丝，并在此处将玻璃管拉下，以制备两个微电极。操作简单。我们的第一步是用染料填充微电极。这里有一个小技巧：实验时只需在尖端填充几微升染料即可。

无需填满所有部分。注意细节。仅填充尖端部分。

让我们开始一个实验。这里培养皿中的细胞处于钠溶液中，银丝连接至电流发生器。

现在需要将微电极连接到前置放大器的头部支架上。在此头部支架上，还有另一根银丝与电流发生器相连。一旦微电极连接完毕，便可将其置入浴槽中。

请注意，移液器尖端正小心地接触浴液。此操作需极为谨慎，以避免移液器尖端撞击培养皿底部。一旦移液器进入浴液，我们即可前往显微镜下寻找微移液管的阴影。

我们建议首先在放大镜下开始寻找。当我们观察到移液管的阴影时，可以使用显微操作器将微电极移向细胞。当微电极非常接近细胞时，可进行一次测试脉冲，以确认微电极是否未被堵塞。

接下来我们将看到的操作中，这里我们正在观察移液器，并将其微调至非常接近细胞的位置。我们可以观察到细胞向左和向右的运动。

然后更换至荧光滤光片。可施加去极化脉冲以检测移液管尖端是否堵塞。由于微移液管已插入细胞内，可施加去极化脉冲将染料导入细胞。

我们在此使用的是游离的黄色染料。在将染料加载到细胞后，如果邻近细胞之间通过缝隙连接相连，我们等待数分钟后，即可观察到染料通过这些缝隙连接扩散，使邻近细胞逐渐变亮。在我们的实验中，可以观察到五个标有星号的细胞显示出荧光。

此处展示了胸腺上皮细胞显微注射实验的一个良好范例，见图A和B。图C和D显示了对胸腺惰性细胞进行的显微注射，注入了裂解型黄色荧光染料（loose free yellow）和另一种染料，其中间隙连接不可通透，插入图中显示了该结果。图E和F为胸腺上皮细胞系经裂解型黄色荧光染料显微注射后的结果，插入图中同时显示了裂解型黄色荧光染料和间隙连接阻断的情况。实验结果表明，裂解型黄色荧光染料未扩散至邻近细胞。

接下来，我们观察在存在地塞米松的情况下，对胸腺上皮细胞进行显微注射，并在 B 部分进行定量分析。如图 B 所示，地塞米松增加了细胞间的偶联程度。在 100 次注射中，存在该药物时，三个或四个细胞相连的情况更为常见。希望本内容能帮助初学者掌握这一研究细胞间通讯的重要技术。谢谢，再见。