一种用于单细胞多功能化学分析的微流控芯片

以下实验的总体目标是利用荧光或免疫分析方法分析单细胞裂解物。首先构建微流控装置，并将抗体包被于内腔表面；随后在第二步中将单个细胞固定在捕获结构中，并暴露于多种试剂以刺激细胞产生响应。

环形阀门迅速关闭，裂解缓冲液流经装置。环形阀门短暂打开，细胞在微腔室内裂解，由于体积微小，释放的蛋白质得以在高浓度下与抗体结合。随后，环形阀门再次打开。

对反应室进行清洗后，将检测试剂引入封闭的微反应室中。使用荧光显微镜随时间监测荧光强度的增加，结果表明该系统能够定量且可靠地检测来自单个细胞的目标分析物。该方法有助于回答单细胞分析领域中的关键科学问题。

特别是，它对细胞在化学环境变化下的响应进行了系统性研究。我们可以观察到，由于化学刺激导致细胞内分子的上调或下调。该技术具有两个主要优势。

第一，我们可以使固定化的细胞暴露于一个确定的化学环境中，该环境可以是恒定的或周期性变化的。第二，我们可以在没有交叉污染或分析物因运输而损失的情况下，对分析物进行高灵敏度和高特异性的重新分析。首先，按照随附的文字方案制备三种不同的SU8母体晶圆。

其中一个用于制作流体层，一个用于控制层，第三个用于微接触印章。然后开始制备微流控芯片，首先准备10:1的PDMS与固化剂混合物。充分混合两部分，并将溶液脱气30分钟，直至混合物中无气泡。

接下来，将晶圆置于培养皿内的控制层中，并用胶带固定在底部。倒入约50克PDMS，形成厚度为4至5毫米的层，然后将晶圆置于80摄氏度的烘箱中至少2小时，以确保PDMS完全固化。对微接触印刷用晶圆重复相同操作，但使用约20克PDMS而非50克，从而形成厚度为4至5毫米的PDMS层。

制备底层时，将一层40微米高的PDMS以2000 RPM的转速旋涂60秒至带有微流控层的晶圆上。当所有部件均完成固化后，在80摄氏度的烘箱中加热固化PDMS层一小时。

从晶圆上取下控制层，并用剃刀辅助将其切成小片。然后使用1毫米的活检穿孔器打孔以制备压力连接孔，并用胶带覆盖通道用于储存。接着，从微接触印刷晶圆上方取下PDMS，并制备与腔室区域大小相同的印章。

将它们存放在无尘抽屉中，直至使用。然后将旋涂晶圆和四到五毫米厚的控制层放入等离子清洗仪中。在0.75毫巴的氧气等离子体条件下，以18瓦功率处理45秒。

等离子处理后，在具有较大工作距离的显微镜下迅速对齐两层。在已放置的上层部件周围添加一些多余的PDMS，以方便后续从晶圆上剥离PDMS。然后将晶圆置于80摄氏度的烘箱中至少一小时。

固化后，使用解剖刀小心地将PDMS从晶圆上剥离，并用1.5毫米活检穿刺针在微芯片上打孔，以留出用于流体连接的穿孔。此外，通过切割200微升移液器吸头的上部，并使用一些备用的半固化PDMS，在微芯片上制作一个储液池，然后将其粘接在顶部。

然后将芯片在 80 摄氏度的烘箱中固化至少一小时。首先清洁载玻片和 PDMS 部件。用肥皂清洗载玻片。

用蒸馏水冲洗，然后再用乙醇冲洗。使用氮气流干燥载玻片。用胶带去除PDMS上的任何碎屑和灰尘颗粒。

然后将PDMS部件和清洗后的玻璃片放入等离子清洗仪中，在18瓦功率下处理45秒，以确保牢固键合。等离子处理后，将芯片置于加热板上加热5分钟。键合完成后，剪去几个200微升移液器吸头的下端，用含有4% BSA的过滤PBS溶液填充10至15微升，并插入装置的进样口。

然后使用剪去尖端的吸头，加入10至15微升PBS，将其放入对照通道中。接着将芯片放入离心机，以800 × g离心5分钟，使液体充满通道。如果任何通道中仍有气泡残留，请重复此步骤，直至通道完全充满液体。

将封闭液在室温下孵育至少30分钟。然后以每分钟10 µL的流速用PBS冲洗流体层中的溶液。使用注射泵，该装置现在已准备好进行细胞实验。为免疫测定预印玻片，将PDMS微接触打印印章与0.5%生物素化BSA在洁净的培养皿中孵育。

半小时后，用蒸馏水彻底且快速地清洗印章，并用氮气流吹干印章。干燥后，迅速将印章放置在已清洁的玻璃载片上，以转移图案化的生物素化BSA。放置后不要移动印章，并检查印章是否与玻璃载片完全接触。

如果未完全贴合，可轻敲印章，但不要用力按压。然后将印章连同微流控芯片的上部一起放入等离子体腔室中，在18瓦功率下暴露于氧气等离子体中45秒。等离子体处理后，将印章从玻璃载片上取下。

在表面呼吸会使图案显现。将微型腔室对齐放置在打印好的表面上。对齐后，将芯片置于50摄氏度的加热板上30分钟，以封闭剩余表面；随后用离心机将4%经无菌过滤的PBS BSA溶液注入芯片（操作如前所示），孵育微芯片至少30分钟，然后以每分钟10微升的流速用PBS冲洗流体层中的溶液。

使用注射泵，可直接使用该芯片，或在4°C的湿盒中保存长达两周。接下来，将PBS中的avadon引入储液池，以形成完全功能化的结合表面。随后使溶液流动，将avadon通过流体通道输送。

用 PBS 充分冲洗储液池，并冲洗通道。然后向储液池中加入蛋白 G，并使其流经通道。用 PBS 冲洗储液池和芯片，以洗去多余的蛋白 G。

接下来，将目标抗体加入储液池，并使其流经微通道。然后停止流动，孵育以促进结合，再用 PBS 洗涤通道。在引入细胞前，可使用荧光标记的类似物检测打印过程的质量。使用无酶解离缓冲液收获贴壁细胞（如此处所示的 HEK 293 细胞），随后过滤以减少细胞团簇数量；过滤完成后，将细胞悬液装入注射器中。

每毫升300,000个细胞，使用注射泵以正向流体将细胞加载到芯片上，流速为每分钟10至20微升，持续约三分钟，适用于此类贴壁细胞，以防止细胞在捕获结构填满后非特异性地附着。当捕获结构充满细胞后，通过向顶层施加三巴压力来封闭腔室。然后使用显微镜观察腔室。若发现大量细胞非特异性地黏附在腔室内表面，应迅速打开腔室，并以每分钟10至30微升的流速用细胞解离缓冲液尝试将其冲洗掉。

对于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）检测，向裂解缓冲液中加入 2 毫摩尔葡萄糖-6-磷酸、0.5 毫摩尔 NADP⁺、0.5 单位/毫升 DIA 阵列以及 0.3 毫摩尔 RIN，并确保充分混匀。通道清空后，以 30 微升/分钟的流速将 G6PDH 裂解缓冲液通过芯片。在裂解缓冲液流动过程中，迅速打开并关闭各个腔室，保持开启 500 毫秒，以便裂解液进入腔室，并在裂解开始后立即监测动力学反应。

在此示例中，可随时间监测荧光产物。图中显示的是一组腔室阵列，这些腔室先填充了橙色食用染料，然后通过加压微腔上方的控制层将其封闭。腔室封闭后，用绿色食用染料冲洗通道，以显示腔室的密封性。

每个腔室仅含有625皮升的液体体积，可使裂解细胞释放的分子浓度保持在足以进行分析的高水平。此外，可通过控制阀门的开关方式，有效避免腔室之间的交叉污染。在这些腔室中，可检测诸如单个PMA激活的U 937细胞所释放的溶酶体数量等分析物，该细胞可在腔室内通过酶促反应催化生成荧光分子。

绿色线条代表单个细胞所在腔室的荧光强度随时间的变化。黑色虚线表示无细胞腔室的荧光强度。作为对比，本实验通过检测细胞内酶G六PDH来显示有毒分子对膜完整性的效应。

黑线代表无毒性影响的对照样本，而橙线代表受所示毒素影响的细胞。这是一个针对细胞内蛋白的免疫测定示例。将GFP抗GFP抗体固定在表面，细胞裂解后，利用turf显微镜观察GFP蛋白的结合动力学。

时间点0.1表示在该时刻加入了裂解缓冲液；在时间点0.2，绿色荧光蛋白（GFP）开始在表面积累，表明细胞裂解已经发生，GFP已扩散至表面。在时间点0.3，GFP与抗体的结合完成。在此最后一个示例中，释放的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）与表面的捕获抗体结合，随后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体。

一旦所有未结合的检测抗体被洗去，便加入检测试剂，并让反应进行一段时间。以下是使用该方法测得的U 937细胞和HEC 293细胞中先前存在于细胞内的GA DH含量在动物数量间的比较。观看本视频后，您应充分了解如何制备微流控芯片、如何修饰表面以实现免疫分析，以及最终如何利用该装置进行单细胞分析。

该方法可用于帮助回答单细胞生物学领域的许多引发性问题。