利用氢交换质谱法分析蛋白质动力学

以下实验的总体目标是分析蛋白质的构象柔性及其在环境变化、配体结合或蛋白质-蛋白质相互作用下的改变。该目标通过在不同条件下预先孵育目标蛋白质来实现，这些条件可能影响蛋白质的构象，例如配体结合。随后将反应混合物稀释至重水（D₂O）中，孵育不同时间间隔，再通过液相色谱-质谱联用技术分析肽骨架中氘代的掺入程度。

由于酰胺基团在受到保护的区域中氘的掺入量减少，通过比较实验在有和无结合伴侣存在时的肽段质谱图，可观察到质谱图中氧化氘同位素分布（OID）因质子与氘核之间的质量差异而发生偏移。在加入结合伴侣后表现出显著保护效应的区域，可能是潜在的结合位点。根据序列覆盖度以及是否存在重叠肽段，可将结合位点精确定位至少数几个氨基酸残基。

该方法有助于解答蛋白质折叠和蛋白质动力学领域的关键问题，例如蛋白质如何折叠、如何去折叠，以及它们如何响应温度升高或重金属等物理和化学因素的影响。相似的结合及蛋白质-蛋白质相互作用如何影响蛋白质的构象。该方法对于蛋白质药物的研发也极为重要，可用于验证蛋白质的正确折叠以及进行常规质量控制。

通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到一些困难。例如，如果蛋白质不能被胃蛋白酶有效消化，则序列覆盖度会较低。如果蛋白质极易发生聚集，则可能在孵育过程中或加入淬灭缓冲液后发生聚集，导致质谱仪中的信号强度降低。

在本实验中，我们将利用氢交换质谱法研究酵母分子伴侣HP 90与其共伴侣Sty one的结合。Sty one与HP 90结合，并通过抑制HP 90的ATP酶活性来促进客户蛋白的结合。开始本实验前，请按照文本方案中的说明准备缓冲液、样品和磁珠。为准备酰胺氢交换所用色谱柱，先拧开保护柱的一端，小心取出内部的滤膜。

将装填漏斗拧到色谱柱的开口端。使用1/16英寸接头将一个空的5毫升注射器连接到色谱柱底部出口。确保将其紧密固定至保护柱，保证气密性。

在漏斗顶部加入几滴浆料珠状材料。拉动注射器的活塞，将浆料通过漏斗吸入保护柱中。继续在漏斗上添加更多浆料珠状材料，并重复操作，直至保护柱完全填满珠状材料。

然后在将滤膜和滤圈紧密安装到开口端之前，先取下漏斗。将色谱柱端盖拧紧到保护柱上，并从另一侧取下注射器。用堵头封闭保护柱的两端。

为防止色谱柱填料干燥，需先搭建氢交换质谱分析系统。首先将捕获柱连接至高效液相色谱（HPLC）系统。使用含0.1%甲酸的溶剂，将泵A的流速设为0.4毫升/分钟，以平衡色谱柱。

校准质谱仪后，将高效液相色谱（HPLC）的出口连接至质谱仪的进样源。为首先确定胃蛋白酶肽段，先将胃蛋白酶柱连接至系统，然后再连接分析柱。在控制软件中设置色谱和质谱参数，选择梯度类型及质谱分析方法。

选择长梯度以确保良好的色谱分辨率。在质谱仪上启用串联质谱模式。在100微升H₂O缓冲液中制备100至200飞摩尔的热休克蛋白90或HSP 90。

加入100微升淬灭缓冲液，通过上下吹打混匀。使用汉密尔顿注射器将200微升样品注入进样阀的进样口。将进样阀切换至“进样”位置，并启动色谱程序。

接下来，通过将生成的肽段与数据库进行比对，鉴定热休克蛋白90的胃蛋白酶肽段。通过加入冰水将系统温度降至0°C。在不使用串联质谱的情况下，重复此步骤，并采用将用于实际氢交换实验的梯度条件。

对于热休克蛋白90和STI1，使用10分钟梯度，从90%溶剂A、10%溶剂B转变为45%溶剂A、55%溶剂B，确定在该梯度条件下鉴定出的胃蛋白酶肽段的保留时间，并建立一个包含肽段序列、肽段电荷、状态和保留时间的列表。该列表将用于氢交换实验后鉴定每条肽段。为鉴定蛋白质-蛋白质相互作用界面，首先需建立梯度和质谱方法。

在控制软件中，使用10分钟线性梯度，从90%溶剂A、10%溶剂B变为45%溶剂A、55%溶剂B。加载一种质谱方法，该方法针对300至1,500质荷比范围内的检测进行优化，尽管大多数肽段的质荷比将低于1000。将进样阀设置为加载位置，并设置六通阀。

在上样脱盐步骤中，将上样泵的流速设置为0.4毫升每分钟。在按照文本方案运行完未改变的参照样品和100%对照样品后，准备20至100皮摩尔的热休克蛋白90，溶于1至5微升的体积中。加入温度调节后的重水缓冲液，使样品体积达到100微升，并按照文本方案中先前确定的精确孵育时间进行孵育。

在确定交换的动态范围时，加入100微升预冷的淬灭缓冲液，快速吹打混匀两次后，立即将200微升样品注入HPLC的进样阀。将进样阀切换至“进样”位置，并立即启动色谱程序。两分钟后，将六通阀从脱盐上样位置切换至洗脱位置。

对每种蛋白质分别进行此操作，以确定在没有相互作用蛋白存在的情况下，每个肽段的氘掺入量。将热休克蛋白90与至少两倍过量的STI1混合，以使平衡向结合状态偏移，在所需温度下孵育直至复合物形成达到平衡。孵育后，加入温度已调好的重水缓冲液，使样品体积达到100微升，并精确孵育一段定义的时间。然后加入100微升冰冻的淬灭缓冲液，快速上下吹打混匀两次，立即注入蛋白质样品并按之前方法运行。

使用合适的软件分析所获得的数据，并利用确定的保留时间在分析中查找每种肽段。计算未修饰蛋白及氢交换实验中同位素分布的质心偏移（OID），比较目标蛋白单独存在以及与过量结合伴侣共存时的氘掺入情况。该分析可通过商业软件自动完成，或使用电子表格程序 M 手动完成。通过比较氧化氘标记后 STI1 肽段谱图在有无 HS P 90 存在下的差异，可直接检测 HSP90 与 STI1 之间的蛋白质-蛋白质相互作用。

最终的差异图显示，在HSP90存在的情况下，TPR2A和TPR2B区域的多肽大多表现出显著的保护效应，表明这些区域与HSP90发生相互作用。TPR2A区域的保护效应可从STI1-TPR2A-TPR2B与HSP90多肽复合物的晶体结构中得到合理解释，该结构中根据酰胺质子免受氘代掺入的数目进行着色。在蛋白质-蛋白质相互作用中，并不总是能观察到如此清晰的保护现象。

在STI 1存在的情况下，HSP 90的保护作用不如STI 1显著，且保护区域也不如STI 1集中。所有肽段均显示出氘代掺入的保护作用略有增强。图中展示的是酵母HSP 90的卡通示意图，根据酰胺质子受保护免于氘代掺入的数量进行着色；STI 1使HSP 90整体稳定，因为在STI 1存在时，该蛋白质的任何区域均未显示出更高的灵活性。

目前尚不清楚这种氘掺入减少是源于与 sty one 的直接相互作用，还是通过变构效应产生的。为了确认 HSP 90 的连续标记，采用氢氘交换质谱法来研究不同蛋白质区域的动力学。此处展示的是 HSP 90 核苷酸结合域中第 43 至 62 位肽段的质谱图。

在存在和不存在STI一的情况下，肽段质谱显示氘的掺入具有时间依赖性，并随孵育时间延长而增加。保护程度在孵育过程中随时间变化，在较短的孵育时间内差异较大，而在最长的时间点处交换速率几乎相同。这表明稳定性较低，或存在频繁解离与结合的动态相互作用区域。

在进行该实验操作时，重要的是需始终牢记保持条件严格恒定，并在开始交换反应前确保所有准备工作均已就绪。在完成本方案后，还可采用其他方法来回答更多问题，例如蛋白质复合物中相互作用位点的位置。