时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

构象灵活性在蛋白质功能中起着关键作用，而时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱技术的总体目标正是研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。该方法有助于回答结构生物学领域的一些关键问题，例如瞬时蛋白质构象的表征，而这类构象难以通过X射线晶体学和核磁共振等传统高分辨率技术进行研究。该技术的主要优势在于，可在毫秒时间尺度上监测反应过程，这对于表征环状结构域、熔融球状体以及内在无序蛋白质至关重要。

该技术的应用前景可拓展至神经退行性疾病的治疗，因为这类疾病通常涉及内在无序蛋白区域的错误折叠或聚集。尽管该方法可用于研究弱结构蛋白，但它也可应用于其他体系，例如发生催化转化的酶，或蛋白质-蛋白质以及蛋白质-配体相互作用的表征。

开始此操作时，使用激光雕刻机在标准的 PMM8 块上通过一个用于引入试剂的输入通道、一个透析室和一个输出通道来激光刻蚀出芯片。随后，使用旋转工具和厚度为 1/64 英寸的切割片将一根 30 号不锈钢金属毛细管切成两段，每段长 10 厘米。使用砂纸打磨毛细管的末端，可在光学显微镜下观察以辅助完成该步骤。

现在，使用低温烙铁将毛细管熔接到刻蚀的 PMM8 模块中。为了构建连续流动的时间分辨动力学混合器，将一根 40 厘米长的熔融石英玻璃毛细管插入一根约 15 厘米长的 28 号钢制毛细管内。接下来，在内层玻璃毛细管的一端使用低功率激光雕刻参数制作一个 2 毫米的切口，并将该端密封。

这是一个关键步骤，可确保蛋白质的有效正交混合，蛋白质通过凹槽流出，该凹槽位于常见退化区域。凹槽与毛细管末端之间两毫米的毛细管间间距即为混合体积。连接适当尺寸的接头和管套，并接入一个T型连接器，用于输送去污剂。

接下来，在体视显微镜下观察，将内层玻璃毛细管与金属毛细管末端对齐，并标记此处为零毫米位置。将该动力学混合器连接至混合T型管的一端，再将一根40厘米长的熔融石英玻璃毛细管连接至混合T型管上动力学混合器的另一端。对于胃蛋白酶的激活，取20毫克来源于猪胃黏膜的胃蛋白酶，溶于1毫升偶联缓冲液中。

向重悬的蛋白质中加入50毫克NHS活化的琼脂糖微球，于4°C轻轻旋转孵育过夜。次日，在室温下以1000 × g离心2分钟，收集树脂，然后吸除未结合的蛋白质。

随后，将琼脂糖珠与1毫升封闭缓冲液在室温下轻柔旋转孵育1小时。收集树脂并吸除封闭缓冲液后，将胃蛋白酶琼脂糖珠与1毫升5%乙酸溶液孵育5分钟。在室温下以1,000 × g离心2分钟，收集树脂，然后吸除上清液。

重复上述步骤，共进行三次洗涤后，将珠子保存在 1 毫升乙酸中，于 4 摄氏度条件下长期储存。为组装装置，使用无菌刮勺将活化的胃蛋白酶琼脂糖珠悬浮液（溶于 5% 乙酸中）填充至透析室中。将 PMMA 微流控平台置于两块空白的 PMMA 块之间作为盖板以密封装置，并用硅橡胶衬垫形成液体密封。

使用金属夹紧板对装置进行加压密封。然后使用合适的接头将混合T型管连接至装置的入口。现在以每分钟10 µL的流速通过酸通道输送5%乙酸。

然后以每分钟1微升的流速，将50毫摩尔的氨甲酸缓冲液通过蛋白质通道。使用可调节的绝缘载样台，将装置连接至经改造的四极杆飞行时间质谱仪（Qtof）前端，以获得最佳的电喷雾条件。设置好ESI-MS条件后，采集仅含胃蛋白酶的质谱图。

接下来，在先前流动着50毫摩尔乙酸铵缓冲液的位置，以每分钟1微升的流速引入50至100微摩尔的tau蛋白或磷酸化tau蛋白。在开始采集前，让系统平衡至少10分钟，然后采集仅含蛋白的光谱。当tau蛋白或磷酸化tau蛋白正在流动时，通过T型连接器以每分钟3微升的流速引入重水（D₂O），并使其在动力学混合器中发生反应。

为了延长标记时间，手动回拉内层玻璃毛细管的位置，以实现 42 毫秒至 8 秒的混合时间，每次回拉之间需让系统平衡至少 10 秒。该动画展示了一次典型实验的工作流程。蛋白质从切口处流出，并与迎面而来的氘发生混合。

在指定的反应时间内，蛋白质主链M8的氢原子会发生交换，通过回拉蛋白质毛细管可调节反应时间。随后反应被淬灭，并在含有出口ESI针头的微流控平台上进行消化。所得质谱图中包含已消化的蛋白质片段。

针对各个肽段计算其氘代摄取百分比，然后将其映射到蛋白质的三维结构上。天然型与磷酸化 tau 蛋白的消化谱相似，序列覆盖度分别为 77.1% 和 71.7%。此处展示了四个简单肽段的最佳拟合同位素分布及其相应的氘代摄取值。通过各肽段的氘代摄取百分比随时间变化的观测动力学曲线，提取出观测到的实验速率。

计算得到的随机特征谱图用于对比，并用于提取理论内在等级。与预期一致，在通常与二级结构元件相关的范围内未观察到保护因子，证实天然tau蛋白内部氢键较弱。在N端和C端、中心结构域以及易聚集区域观察到显著的保护作用。

在高磷酸化相关的tau蛋白中，观察到整个蛋白质的氘吸收普遍增加。在N端和C端以及六肽区域二中，氘吸收显著上升。保护程度因子采用如图所示的彩虹色谱进行着色。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在数小时内完成。在进行此操作时，重要的是使用HPC级或更高级别的试剂区域，以尽量减少污染物，因为污染物可能干扰分析。在此操作之后，可进一步采用其他方法，如共价标记、化学交联、计算建模和分子对接研究，以匹配蛋白质的三维结构，或确认蛋白质-蛋白质及蛋白质-配体相互作用的区域。

该技术问世后，为结构生物学领域的研究人员探索内在无序蛋白及其结构域（这在神经退行性疾病中最为常见）开辟了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何利用时间分辨电喷雾电离、氢氘交换质谱技术来研究蛋白质结构与动态变化。