一种基于脉络丛上皮细胞的人源血液-脑脊液屏障模型，用于从基底侧研究细菌感染

本方法的总体目标是建立一种基于人脉络丛上皮细胞的血液-脑脊液屏障模型，从而能够从基底侧-外侧研究细菌感染。该方法有助于回答中枢神经系统感染性疾病中的一些关键问题，例如细菌与脉络丛上皮相互作用过程中涉及哪些生物学过程。

该技术的主要优势在于能够分析病原体与上皮细胞基底侧黑色面的相互作用。该方法还可应用于其他研究，例如免疫细胞和肿瘤细胞穿越脉络丛上皮的跨膜迁移研究。我最初产生将人脉络丛乳头状瘤细胞（HIBCCP细胞）用于此方法的想法，是在阅读了Shibata等人于2005年发表的论文之后。

描述细胞系。首先使用无菌镊子将具有3微米孔径、0.33平方厘米生长面积的细胞培养滤膜插入物倒置放入12孔板的各个孔中。然后，用血清移液管向孔中加入约3毫升预热的培养基，轻轻吸去多余液体，直至下层腔室恰好充满。

接下来，在滤膜上加入100微米含10%胎牛血清（FCS）的37摄氏度培养基。添加培养基时，务必避免产生气泡，因为气泡会阻碍细胞充分获取营养。当所有插入物中均加入培养基后，盖上培养板，并将插入物转移至37摄氏度、5% CO2的培养箱中。

现在，用十毫升磷酸盐缓冲液（PVS）清洗一瓶HIBCPP细胞，晃动清洗两次。第二次清洗后，向细胞中加入三毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并轻轻晃动培养瓶。然后将细胞孵育约二十分钟。

孵育结束时，确认细胞已从培养瓶底部脱落并呈圆形。细胞之间并未完全分离，常以团块形式存在。加入17毫升培养基重悬培养物以终止反应，并将悬液转移至50毫升离心管中。

然后，离心收集细胞，并将沉淀重悬于适量培养基中用于计数。接着，将细胞稀释至浓度为每毫升1×10⁶个细胞，轻轻颠倒混匀试管以均匀分布细胞。随后，向每个滤膜小室的上室加入80 µL细胞悬液。

当所有插入物接种完毕后，盖上培养板，放回培养箱中过夜培养。次日，向24孔板的每个孔中加入1毫升培养基。然后用镊子取出每个插入物，弃去内部的培养基，将插入物正面朝上放入24孔板的各个独立孔中。

将滤器插件从12孔板转移至24孔板时，注意不要触碰到滤膜上表面正在生长的细胞。向插件中加入0.5毫升新鲜培养基，然后将培养板放回培养箱。每隔两天将插件转移至含新鲜培养基的新24孔板中，从而更换上室中的培养基。

为了测量细胞的跨上皮电阻（TEER），首先将上皮组织伏欧计的电极尖端浸入80%乙醇中。15分钟后，将电极从乙醇中取出，使其自然干燥。随后，将电极尖端放入一份传代培养基中，持续15分钟。

当电极平衡后，将较长的一端置于细胞培养板一个孔的下层室底部，较短的一端伸入滤插室中。先在无细胞的培养基中测量细胞培养滤插的电阻值，以获得空白值。随后，测量每个接种细胞的滤插的跨上皮电阻（TEER）值。

测量后，将电极放回80%乙醇中浸泡15分钟，随后储存于干燥管中。当接种HIBCPP细胞的Transwell小室的TEER值超过70 Ω·cm²时，更换培养基，使用添加了5 µg/mL胰岛素和1% FCS的新鲜培养基，并将培养板放回细胞培养孵箱中过夜。为测定小室培养物的细胞旁通透性，向每个小室的上层滤膜室中加入含有50 µg/mL新配制的FITC-胰岛素的低血清新鲜培养基，然后将细胞放回孵箱中继续培养。

当培养物达到约 500 欧姆·厘米² 的跨上皮电阻（TEER）时，以感染复数为 10 的细菌悬液感染细胞，并将细胞放回培养箱中进行相应时间的培养。随后，通过将滤膜转移至含有 1 毫升无血清培养基的新孔中，清洗细胞三次。每次均在滤膜腔室中加入 500 微升相同培养基。最后，通过收集每个细胞培养滤插底部孔中的培养基样品，并在微孔板读数仪中与十种一倍和两倍稀释的 FITC-菊粉标准品同时测定，确定细菌感染后从滤膜腔室穿过细胞层的菊粉浓度。

HIBCCP 细胞表现出特定的屏障功能，使其能够在一定程度上限制分子交换。例如，针对与紧密连接相关的蛋白质 ZO-1、Occludin 和 Claudin-1 进行的免疫荧光分析显示，在细胞与细胞接触部位存在连续不断的信号，表明细胞之间通过连续的紧密连接结构相互连接。

在适当的培养条件下，HIBCPP 细胞表现出较高的膜电位，未经处理时可达到约 500 欧姆·厘米²，同时维持血-脑脊液屏障典型的屏障功能，例如形成膜电位以及对大分子具有低通透性。然而，随着 DMSO 浓度的增加，TEER 值呈剂量依赖性下降，经细胞松弛素 D 处理后也观察到类似的显著 TEER 值降低。此外，添加 2% 体积分数的 DMSO 或细胞松弛素 D 均会导致 FITC-胰岛素通量的通透性显著增加。

此外，HIBCCP 细胞的细菌感染导致两种致病性细菌菌株 MC58 及其荚膜缺陷型突变株对细胞层的显著侵袭，而无致病性的 alpha 14 菌株仅引起轻微侵袭。

在进行此操作时，需要注意在接种细胞后切勿触碰滤膜，因为接触会破坏完整的HIBCCP层。完成此操作后，可进一步采用其他方法，如体外迁移实验，以探究免疫细胞和肿瘤细胞穿越脉络丛上皮细胞的机制。该技术建立后，为药理学领域的研究人员提供了在体外研究底物跨脉络丛上皮转运的途径。

观看本视频后，您应能够充分了解如何制备用于病原体基底外侧感染的HIBCCP细胞模型，以模拟血-脑脊液屏障。请务必注意，操作人类病原体可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，应始终采取适当防护措施，例如在符合安全标准的生物安全柜内操作。