长期慢性 铜绿假单胞菌 小鼠呼吸道感染

本实验的总体目标是在小鼠体内建立持续性的长期慢性铜绿假单胞菌呼吸道感染。首先，培养选定的铜绿假单胞菌菌株；第二步，将细菌与琼脂和矿物油在 50 摄氏度下混合，使细菌包埋于微小的琼脂珠中，然后在 4 摄氏度下缓慢持续搅拌，使混合物冷却固化。

接下来，通过多次使用 PBS 洗涤去除矿物油，并将部分琼脂珠样品进行匀浆后涂布于琼脂平板上。为确定细菌含量，最后一步是将数微升琼脂珠悬液注入小鼠气管，以建立慢性铜绿假单胞菌肺部感染模型。最终可在攻毒后的不同时间点收集支气管肺泡灌洗液和肺组织，将其涂布于琼脂平板，以检测慢性感染小鼠的比例以及存活小鼠气道中的细菌载量。与现有方法相比，该琼脂珠方法的主要优势在于，可在高比例小鼠中实现稳定的长期慢性感染，使细菌载量持续稳定长达一个月。

AGA位点方法可在小鼠肺部营造微需氧环境，使细菌以微菌落形式生长。与囊性纤维化患者黏液中的细菌生长类似，这些方法可帮助研究人员探讨囊性纤维化及其他呼吸系统疾病发病机制中的关键问题，并测试针对铜绿假单胞菌慢性肺部感染的新型疗法。该方法也可用于实现其他病原体的慢性感染，包括伯克霍尔德菌（Burkholderia）、洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia complex）或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；不同病原体的共感染或竞争性实验亦可开展。演示本实验操作的人员为Pheno（博士后）和Camil Riva（本实验室的博士研究生）。在小鼠感染实验前3天，用接种环从-80°C保存的菌种中取一环铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），接种至胰蛋白胨大豆琼脂平板，于37°C过夜培养。

第二天，挑取一个单菌落接种于5毫升胰蛋白胨大豆肉汤中，在37°C、200 rpm条件下于摇床中过夜培养。次日早晨，取少量过夜培养的细菌培养物，按1:50比例稀释于磷酸盐缓冲液中，然后测定600纳米处的光密度。

接下来，将过夜培养的细菌培养物进行稀释，取2个OD值的菌液加入含有20毫升新鲜TSB的离心管中，在37摄氏度、200转/分钟的摇床培养箱中培养约三到四小时，使其进入对数生长期，直至总OD值达到10至50。当铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）达到对数生长期后，在4摄氏度条件下以2,700 × g离心15分钟收集菌体，并弃去上清液。随后。

将细菌沉淀重悬于1 mL无菌PBS中，充分涡旋以完全重悬。然后取1 mL细菌悬液与9 mL预先平衡至50 °C的液体TSA混合。将此混合液加入已预热至50 °C的大量矿物油中。

立即在室温下搅拌六分钟。搅拌必须使油相产生可见的涡流。随后将混合物冷却至4摄氏度，并以最低速度持续搅拌35分钟。

然后在冰上静置额外20分钟。之后，将琼脂珠转移至50毫升离心管中，在4摄氏度下以2,700 ×g离心15分钟。

准确去除矿物油，用无菌 PBS 洗涤琼脂糖珠沉淀。三次洗涤后重复该步骤六次。最后一次洗涤后，可通过重力沉降而非离心方式收集珠子。

无菌条件下将琼脂珠重悬于20至30毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，并充分匀浆使珠子浓度为每0.5毫升含适量琼脂珠。接着，取100微升匀浆后的珠液加入900微升无菌PBS中进行1:10稀释，随后以此比例连续梯度稀释六次，最终稀释至10⁻⁶。

然后将样品进行系列稀释，包括未稀释液，接种于TSA平板上，稀释至10的负6次方，于37°C培养平板。使用倒置光学显微镜在多个视野下测量微珠直径。

在对小鼠进行攻毒前，微珠直径必须介于100至200微米之间。通过计数TSA平板上的菌落形成单位数量，确定琼脂微珠悬液中每毫升的CFU数量。随后调整琼脂微珠体积，使其浓度达到每毫升2至4×10⁷ CFU，以获得每50微升含1至2×10⁶ CFU的最优接种量。

将一只预先用氯胺酮和赛拉嗪麻醉的6至8周龄雄性小鼠仰卧置于加热垫上，用70%乙醇消毒其毛发。通过皮肤的垂直切口暴露气管，接着用镊子分离覆盖在气管上的肌肉。

然后用1毫升注射器吸取最多50微升的琼脂珠悬浮液。接着，用导管进行气管插管，并将装有琼脂珠悬浮液的1毫升注射器连接至导管。轻轻推动注射器的活塞，使珠子缓慢植入肺部。

然后使用缝合夹闭合切口。在此步骤中，将安乐死的小鼠置于仰卧位，并用70%乙醇对其皮毛进行消毒。

接下来，通过垂直切开皮肤暴露气管和胸腔。随后，剪开膈肌以暴露肺部。使用镊子将缝合线穿入气管下方，并通过导管对气管进行插管。

然后拉动缝合线的两端，将导管固定在气管上，而不是将线缠绕在气管周围。现在使用1 mL注射器吸取1 mL细胞培养基，并将其连接到导管上。推动注射器活塞以立即灌洗肺部，回收液体后将其保存在15 mL离心管中。

用总共三毫升培养基重复此步骤三次，然后将支气管肺泡灌洗液置于冰上，用于肺组织的收集与分析。从小鼠体内切除肺组织，用无菌 PBS 冲洗。

然后分离肺叶，将其放入含有两毫升无菌 PBS 的圆底管中，置于冰上保存。在无菌条件下将肺组织匀浆并进行连续稀释。

将匀浆液按1:10的比例用PBS稀释。然后进行系列稀释，包括未稀释的样品，接种于TSA平板上，并在37摄氏度下培养过夜。从冰上取出BAL液体，在倒置光学显微镜下按1:2的比例用Turk溶液稀释。

使用血细胞计数板对Burker细胞计数室中的细胞进行总数计数，对支气管肺泡灌洗液（BAL）在4°C条件下以330 ×g离心8分钟进行差速细胞计数。随后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于含10%胎牛血清的细胞培养基中，浓度为每毫升100万个细胞。将显微镜载玻片和滤膜按正确位置放入细胞离心涂片机（cyto spin）的相应槽位中，确保纸质滤膜朝向其中心位置。

将每份样品150微升移液至相应的孔中，进行胞嘧啶和离心处理，即在300 × g条件下离心5分钟。然后，在染色后应观察细胞涂片，可在显微镜下进行差异计数。该图显示了铜绿假单胞菌PA O1参考菌株和RP 73慢性感染的时间进程。

每个时间点的临床菌株。直方图中红色表示菌血症导致的死亡率百分比，灰色表示存活率百分比，白色表示清除感染的动物百分比，绿色表示建立慢性感染的动物百分比。与PA oh one实验室菌株相比，铜绿假单胞菌RP 73临床菌株在建立慢性感染方面效率更高。

存活的小鼠在指定时间点被实施安乐死，取出肺组织，进行匀浆并在TSA平板上培养，以测定细菌载量。P oh one与RP 73菌株在小鼠肺组织中的生长曲线显示，感染后第3天，P oh one菌株的细菌数量高于RP 73。随后，从第7天开始，当慢性感染建立后，两种菌株的细菌载量均稳定在每肺10⁴至10⁵ CFU之间。在RP 73临床菌株感染7天后，评估了支气管肺泡灌洗液（BAL）中炎性细胞的募集情况。

与未感染小鼠相比，RP 73 感染小鼠的总白细胞数量显著升高。其中占比最高的细胞是中性粒细胞，表明先天免疫系统对慢性感染产生了显著反应。在下方方框中，箭头指示了经细胞离心涂片后在载玻片上观察到的中性粒细胞和一个巨噬细胞。

图中显示了小鼠肺组织在慢性感染 rp. 73 临床菌株 7 天后的苏木精和伊红染色结果。如箭头所示，支气管腔内可见菌珠，且存在细菌细胞的微菌落。在感染区域，支气管和肺实质表现出大量炎性细胞浸润。

未感染小鼠的气道中无炎症细胞浸润。BES 的直径及其最终浓度是非常重要的细节。为了获得良好的实验结果，必须注意在冷却阶段，微球的尺寸会受到搅拌速率的影响，且起始细菌量会影响微球的最终稀释度。此外，选择适当的假单胞菌菌株（该菌株应导致小鼠低死亡率并产生高比例的慢性感染）可最大限度地减少实验所需小鼠的数量。

小鼠感染后，需进行细菌计数。此外，为研究细菌感染引起的肺部炎症反应，可进行支气管肺泡灌洗液中的总细胞和差异细胞计数、细胞因子分析、髓过氧化物酶检测以及组织学分析。请注意，操作铜绿假单胞菌等机会性病原体时，必须始终采取必要的安全措施，例如佩戴手套、在生物安全柜内操作细菌以及使用无菌技术。

合适的动物模型的建立使得新型抗菌和抗炎分子的临床前测试成为可能。这对于囊性纤维化或其他呼吸系统疾病患者肺部感染的未来治疗干预具有重要意义。