利用荧光蛋白在活细胞中可视化并定量分析Chlamydia包涵体的生长动态

本实验的总体目标是可视化并定量分析活细胞中沙眼衣原体包涵体的生长动态。首先构建表达荧光蛋白（如GFP）的荧光宿主细胞，使其在细胞质中稳定表达。随后，用沙眼衣原体感染宿主细胞，并进行孵育。

然后通过活细胞荧光显微镜观察感染的细胞。最后，通过显微镜分析软件对沙眼衣原体包涵体的特征进行量化，最终利用活细胞荧光显微镜可视化宿主细胞内的沙眼衣原体包涵体，并测量包涵体的生物学参数以获得定量结果。与现有的基于抗体计数的方法相比，该技术的主要优势在于，这种反向成像策略可用于活细胞，并可与其他荧光标记联合使用，从而定量分析所有沙眼衣原体物种的包涵体动态。

此外，与常规的细胞内细菌标记方法不同，该方法能够照亮活细胞中的包涵体膜，从而揭示这种容纳病原体的区室的重要动态特性。根据文本方案，首先制备荧光hela细胞，将表达GFP的hela细胞接种至合适的培养容器中，例如用于高分辨率成像的玻底培养皿，或用于IFU测定和多孔板筛选的4孔或24孔板。将保存的Crich Cotus（或其他所需衣原体菌株）冻存管置于冰上解冻，并用HBSS稀释至所需的感染复数。为进行Crich Cotus的静态感染（LGV血清型VL2），吸除孔中培养基，并使用HBSS洗涤GFP标记的hela细胞。

将稀释后的细菌加入孔板中，在25摄氏度下孵育两小时，吸去培养基并用HBSS洗涤细胞。随后加入生长培养基，在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育细胞，以进行离心辅助感染，使用crich感染血清型D或其他任何衣原体菌株。用HBSS洗涤GFP hela细胞，并将稀释后的细菌加入细胞中。

然后将感染的细胞培养皿放入台式离心机的摆动桶转子多孔板架中。在25摄氏度下以900 × g离心1小时。随后在生物安全柜中将培养容器置于37摄氏度二氧化碳培养箱中孵育1小时，吸去上清液，用HBSS洗涤细胞两次，然后加入生长培养基。

将感染细胞的培养皿置于 37 摄氏度条件下孵育。为观察沙眼衣原体包涵体，从二氧化碳培养箱中取出表达 GFP 的沙眼衣原体感染 Hela 细胞，使用不含酚红的 RPMI 培养基加 5% FBS 更换原有培养液。将培养皿或多孔板置于倒置荧光显微镜上，选用 20 倍或更高倍数的油镜物镜。通过成像软件，识别呈绿色且细胞内含有较大黑色空泡的沙眼衣原体感染 GFP Hela 细胞。

在采集设置对话框中，配置软件以采集绿色通道及样本中添加的任何其他通道。使用捕获/录制按钮，在所需时间点采集感染后的图像。将感染衣原体的 GFP 标记 HeLa 细胞从培养箱中取出，置于倒置荧光显微镜上进行观察。

聚焦于细胞中包涵体直径最大且产量最高的中平原区域。每个孔至少在10个视野中获取边缘清晰的图像。孔通常代表重复样本或实验变量。

在“测量”选项卡中查找GFP hela细胞时，使用“查找对象”命令并选择绿色通道。根据细胞的相对强度调整阈值强度。通过肉眼手动计数包涵体或黑色区室以及GFP hela细胞的数量，或使用成像软件算法自动识别并计数包涵体。

通过仅保留大于五个平方微米的对象来筛选选定对象。将此称为群体一。使用该群体，应用“填充对象中的孔洞”命令作为输入，此步骤生成群体二。

将种群二减去种群一，得到被标记为阳性的沙眼衣原体包涵体，定义为种群三。使用“过滤种群”命令对种群三应用大小过滤器。例如，对于感染时间为24小时或更长时间的细胞内的包涵体，若需保留大于25平方微米的对象，则将大小过滤器设置为保留大于25平方微米的对象；而对于较早感染时间的样本，可将大小过滤器设置为保留大于4平方微米的对象。

由于这些包涵体更小，通过尺寸过滤可获得被定义为包涵体的物体群体。利用成像软件从图像中计算定量数据，例如包涵体数量、包涵体大小以及包涵体周长。在感染衣原体后，包涵体可清晰地表现为黑色斑点，而宿主细胞或在宿主细胞内表达荧光蛋白的衣原体也可见，其清晰度可用于在多个视野和/或不同处理条件下进行自动识别。

如本图所示，该方法的一个主要应用是测定活感染细胞中沙眼衣原体包涵体形成单位，从而避免了耗时且昂贵的免疫荧光检测程序。这种成像方法的另一个关键特点是可轻松应用于任何沙眼衣原体物种或菌株。在本示例中，对感染了四种沙眼衣原体物种或菌株之一的GFP标记HeLa细胞进行了时间过程分析，每种物种或菌株均独立进行。

对包涵体进行标记和分析，以计算在指定时间下每个细胞中包涵体的平均面积、周长及数量。这些参数为衣原体包涵体的生物学特性提供了重要信息，包括其与宿主细胞的相互作用方式。此处展示的是一段视频，显示了感染表达GFPC、Tracom L2的mCherry-Hela细胞，该视频由感染后48小时开始、每5分钟拍摄一次、持续125分钟的延时图像组成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何使用这种反向成像技术，不仅用于观察沙眼衣原体包涵体，还可定量分析包涵体的动态特征，例如包涵体面积、周长以及每个细胞内的包涵体数量。与传统的可视化技术相比，该技术成本较低，且适用于所有沙眼衣原体的种和株。