活细胞荧光显微镜观察微生物细胞生长过程中的关键过程

本显微镜技术的总体目标是观察细菌细胞生长过程中的核心过程。该方法使我们能够探究细菌学中的重要问题，例如细菌细胞生长与分裂过程中关键生命活动是如何协调进行的。该技术的主要优势在于，我们能够利用荧光试剂在活细胞中直接观察细菌细胞表面及其内部结构。

此处，我们采用该方法来深入探究根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中的关键生物学过程。然而，该方法也可推广至其他细菌，用于研究其生长特性。实验开始时，使用无菌的木签或移液器吸头，从根癌农杆菌（A. tumefaciens）的野生型或突变株中挑取单菌落，接种至 3 毫升 ATGN 生长培养基中。

在28摄氏度、225转/分钟条件下过夜培养。次日，使用分光光度计测定OD600。随后将细胞培养液稀释至OD600约为0.2，并继续培养细胞至OD600达到0.6。

将一毫升对数期培养物分装到三个微量离心管中，在台式离心机中以 7,000 × g 离心五分钟，沉淀细胞。用一毫升 PBS 重悬每个细胞沉淀，然后分别加入一微升 DMSO Orange 储存液或 DAPI 储存液。

用移液器轻轻混匀，将重悬的细胞在避光条件下孵育5分钟。在7,000 × g离心5分钟，使细胞成团，然后将沉淀重悬于1毫升PBS中以去除过量试剂。随后再洗涤细胞两次，最后将沉淀重悬于50微升PBS或培养基中。

为了进行同步延时成像，将每种处理组的十微升细胞混合至新的微量离心管中。为制备用于细胞成像的琼脂糖垫，使用盖玻片作为参照，用手术刀沿其边缘切割出一块22毫米×22毫米的实验室用膜。在实验室用膜的中央切去一个方形区域，保留约2至5毫米的边缘，作为琼脂糖垫的垫圈。

然后，弃去中间的切下部分。将薄膜垫圈放置在已用不含氨和酒精的清洁剂清洗过的载玻片上，并使用设定为 70 摄氏度的加热块或火焰加热载玻片，直至薄膜略微熔化并粘附在玻璃上。

接下来，通过将约 0.075 克琼脂糖与 5 毫升培养基混合于一个小烧瓶中来制备琼脂糖溶液。将溶液放入微波炉中加热，并定期摇动以混匀，直至琼脂糖完全溶解且溶液变得澄清。将琼脂糖溶液保持在 55–70 摄氏度，并在 48 小时内用于制备多个琼脂糖垫。

将温热的琼脂糖培养基滴加到垫圈中央，然后在垫圈上放置盖玻片，以均匀分布琼脂糖。将载玻片置于凉爽且水平的表面上，静置约两分钟使其凝固。

现在，小心地将盖玻片从琼脂糖垫上移开，然后在室温下让琼脂糖垫自然干燥一到两分钟，直至垫片表面看起来干燥。正确制备琼脂糖垫对于获得高质量图像至关重要。切勿在质量不佳的垫片上进行成像。

如果琼脂糖垫干燥、起皱或撕裂，最好不要再偷懒，而应重新制作一个新的垫片。然后，使用解剖刀切去一小条琼脂糖，以形成一个大小约为2×7至10毫米的气室。根癌农杆菌（A. tumefaciens）细胞通常在气室附近生长最佳。

在琼脂糖垫上点样 0.8 至 1 微升的细胞。然后轻轻将盖玻片覆盖在琼脂糖垫上，使细胞均匀分布在垫的表面。对于长期延时成像，使用融化的 Valap 封闭盖玻片的边缘。

务必使用瓦氏封片剂（Valap）密封盖玻片的所有边缘和角落。若未做到这一点，可能导致在琼脂糖凝胶垫时间序列成像过程中出现样本漂移。进行落射荧光显微镜观察时，将浸油涂抹于所需物镜上，并将倒置的载玻片放入显微镜载物台的玻片夹中。

使用调焦旋钮将细胞调至清晰对焦。根据需要选择荧光滤光片，采集相差或微分干涉差（DIC）及荧光图像。可选地，通过在琼脂糖垫气泡附近随机选取十个相邻的细胞视野，采集多个x、y位置的图像。

设置时间序列采集程序，以在设定的时间间隔内成像同相位图像或微分干涉差（DIC）图像。如图所示，细胞在经离心洗涤并用0.1% DMSO孵育后直接从培养物中成像，结果显示单独使用DMSO对细胞形态无影响。在活体A. tumefaciens细胞中，橙色和DAPI均标记了DNA。

在即将分裂的细胞晚期，使用橙色染色可观察到两个不同的类核仁结构，而使用DAPI染色时DNA标记则呈现更弥散的分布。在此项时间推移实验中，等比例的未标记、DAPI标记和橙色标记的野生型A.Tumefaciens细胞在相差显微镜下均能正常生长，表明两种染料均未影响细胞生长。在使用TRITC滤光片的落射荧光显微镜下，细胞在相差模式下同样能够正常生长。

然而，使用 DAPI 滤光片成像时，细胞在 1 小时内停止生长。采用类似方法，也可使用其他荧光试剂来观察细菌的细胞壁或膜结构。此外，许多此类荧光染料可联合使用，以获得细菌细胞表面的全面图像。

对活体细菌中的关键过程进行可视化是令人兴奋的，因为它为我们研究条件突变体或非模式细菌中的这些过程提供了可能。这使我们能够加强对多种细菌物种的研究。