利用表面引发组装技术构建的细胞外基质蛋白纳米纤维与纳米结构

本实验的总体目标是利用表面引发组装技术，由单种或多种细胞外基质蛋白构建自支撑的纳米纤维、纳米结构和二维基质。该过程首先通过将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物倾倒至具有拓扑结构的母模上并使其固化，制备PDMS印章；第二步是将固化的PDMS印章切割成所需形状，并将其浸入含有目标细胞外基质蛋白的溶液中进行包被。

接下来，将印章清洗、干燥，并通过微接触印刷技术将其印至涂有聚-N-异丙基丙烯酰胺（poly N-isopropyl acrylamide，简称 pNIPAM）的玻璃盖玻片上。最后一步是用40摄氏度的温热去离子水水合盖玻片，并使其逐渐冷却，从而降低溶液温度。当温度降至约32摄氏度以下时，会触发对温度敏感的 pNIPAM 层溶解，进而释放已组装的蛋白质纳米纤维或纳米结构。

最终，组装形成的纳米纤维和纳米结构在溶液中呈游离状态，可通过相差显微镜和/或荧光显微镜确认，并可用于组织工程支架等进一步的应用。与现有的面分离或静电纺丝等方法相比，该技术的主要优势在于能够采用一种真正模拟细胞在体内正常构建细胞外基质（ECM）纤维的方式，来设计ECM蛋白纳米纤维。表面引发的组装技术具有多项独特优势，包括能够调控蛋白质组成、纤维形态以及支架结构。

此外，我们可以利用细胞外基质蛋白（如纤连蛋白和IV型胶原蛋白）来构建ECM蛋白纳米纤维，而使用其他方法实现这一目标已被证明较为困难。该方法有助于回答组织工程领域的关键科学问题，使研究人员能够开发出具有特定且明确定义的物理和化学信号的支架结构，从而调控多种细胞行为，如细胞黏附和分化。如果您初次使用该技术，应持续检查干细胞的质量以及微接触印刷图案的保真度。

这对于获得正确的细胞外基质（ECM）纳米纤维和纳米结构的组装至关重要。开始此操作时，通过将弹性体基础剂与固化剂按10:1的质量比混合，制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物，通常使用80克基础剂和8克固化剂，以确保有足够的PDMS覆盖在厚度为1厘米的母模上。使用离心搅拌器混合PDMS，设置如下：2000 RPM下混合2分钟，2000 RPM下脱气2分钟。足够即可。

在此处的母模上涂布PDMS预聚物，形成一厘米厚的层，然后在65摄氏度下烘烤4小时以固化PDMS。固化后，使用手术刀切割出含有图案的区域，制成PDMS印章。为区分PDMS印章的特征面与背面。

在印章背面的一个角上切出一个缺口。开始此操作时，先清洗直径为25毫米的玻璃盖玻片，将盖玻片在95%乙醇中进行超声处理1小时，然后在65°C的烘箱中干燥。接下来，制备聚异丙基丙烯酰胺（piam）溶液：将piam溶于正丁醇中，浓度为10%。将一块洁净的玻璃盖玻片置于旋涂仪的真空吸盘中央，用移液器吸取200 µL piam溶液滴加到玻璃表面，确保完全覆盖整个表面。

以 6,000 RPM 的转速旋涂盖玻片 1 分钟。将 PDMS 印模在 50% 乙醇中进行超声清洗 30 分钟，随后在氮气流下干燥。所有后续操作均应在生物安全柜中进行，以确保无菌，适用于细胞实验中外源性基质或 ECM 纳米结构与细胞共用的情况。微接触印刷步骤是本实验流程中最困难的部分。

使用前需检查PDMS印章是否存在任何可见缺陷。此外，不要使用存放超过两周的蛋白溶液。将PIAM包被的盖玻片放入封闭的培养皿中，并通过紫外照射进行灭菌。

在生物安全柜中紫外线照射45分钟即可。将200微升蛋白溶液均匀涂覆于每个PDMS印章的图案表面。此处使用的纤连蛋白（Fibronectin或FN）浓度为每毫升无菌蒸馏水中含50微克。

室温孵育一小时后，用蒸馏水清洗PDMS印章以去除多余的蛋白质，并用氮气流彻底干燥。必须完全去除水分，以避免管道过早溶解，以及盖玻片上的Pam涂层不完整和蛋白质转移不当。

必要时，将PDMS印模的图案面与涂有PAM的盖玻片接触，进行微接触印刷。使用镊子轻轻敲击印模背面，以去除任何气泡，并在五分钟后确保接触均匀。从盖玻片上剥离PDMS印模。

在此阶段，根据研究需要，可对其他细胞外基质（ECM）蛋白进行图案化，以构建更复杂、多组分的结构。ECM图案打印完成后，将带有图案的PAM包被盖玻片放入35毫米的培养皿中，并使用相差显微镜检查图案的保真度。

根据图案的不同，可能需要使用CCD相机来分辨图案的特征。如果细胞外基质蛋白带有荧光标记，也可使用荧光显微镜检查图案。确认图案保真度后，向培养皿中加入3 mL 40°C的蒸馏水，使水逐渐冷却以溶解凝胶管。

可以使用相差显微镜监测PAM层以及细胞外基质（ECM）蛋白图案的释放。通常，为了确保ECM蛋白纳米结构已被释放，需将水冷却至远低于PAM的低临界溶解温度（32摄氏度）的室温。如果应用条件不允许使用光学技术，则可通过测量溶液温度来监测释放过程。

释放PAM层后，纳米纤维和其他纳米结构将悬浮在水中。对于进一步的应用，需要对这些纳米织物和其他纳米结构进行操控，但具体方法取决于实验目的。本文展示了代表性结果，以证明表面引发组装（SIA）能够精确调控细胞外基质（ECM）蛋白纳米纤维的尺寸，实现对纳米纤维结构的精准工程化构建。

将长度为50微米、宽度为20微米的纤维连接蛋白矩形阵列图案化于PIAM涂层的盖玻片上，加入40摄氏度的去离子水，随后冷却至PIAM的低临界溶解温度以下。温度降低触发PIAM溶解，从而释放出丝素蛋白纳米纤维。纤维在释放后因自身固有的预应力而发生收缩。

当将纤维连接蛋白纳米纤维图案化至 piam 表面后，在释放前对其进行 Alice 分析，结果显示纤维尺寸均一，平均长度为 50.19 ± 0.49 微米，平均宽度为 19.98 ± 0.17 微米。释放后，纳米纤维显著收缩，但仍保持尺寸均一，平均长度为 14.15 ± 0.92 微米，平均宽度为 2.65 ± 0.32 微米。原子力显微镜提供了与 SIA 释放过程相关的纤维尺寸变化的更高分辨率图像。

值得注意的是，释放前的纤维厚度均一，约为5纳米，而释放后的纤维厚度则达到数百纳米量级，同时长度和宽度均有所减小。利用SIA工艺，可制备多种具有可调尺寸、形状和成分的细胞外基质（ECM）蛋白纳米结构。例如，可将初始宽度为20微米、长度为1厘米的纤连蛋白纳米纤维图案化至管道表面。

冷却后，PAM 涂层的盖玻片与管道分离。PAM 溶解后，纳米纤维被释放，形成宽度减小至约三微米的长丝状结构。此外，由于图案由用于微接触印刷的 PDMS 印模的表面形貌决定，因此可借此作为概念验证，设计出复杂的细胞外基质（ECM）蛋白纳米结构。

制备了多臂纤维蛋白星状结构。热释放导致臂部收缩，但星状结构中心区域（即臂连接处）未发生收缩。SIA技术也可与其他细胞外基质蛋白（如层粘连蛋白或LN）结合使用，并可将多种细胞外基质蛋白整合至同一结构中。

在此示例中，红色显示的 20 微米宽纤连蛋白正交互联线条与绿色显示的 50 微米宽层粘连蛋白线条被整合到二维纳米织物中，经释放后，两类纳米纤维均发生收缩，但整体的互联性及方形晶格结构得以保持。这些结果表明，SIA 可用于构建具有多种成分和结构的细胞外基质（ECM）材料。最后，展示了一些 ECM 纳米纤维 SIA 操作失败的实例。

其中一个原因是由于细胞外基质蛋白向Piam表面转移不充分，导致不完整图案的释放。在微接触印刷过程中，孔洞、不规则边缘及其他缺陷的存在会产生不完整且在释放时易发生断裂和碎裂的纳米纤维和纳米结构。Pipe PAM的快速溶解也可能导致释放后图案保真度差。

例如，使用20摄氏度的水，该温度已低于piam的低临界溶解温度，将导致piam迅速溶胀并溶解。这会引起纳米纤维如第32秒图像所示发生回缩和断裂，并如第52秒图像所示形成随机且无序的结构。

在开始此操作之前，需检查PDMS微柱是否存在缺陷，并确保所有表面无灰尘。否则，将影响蛋白质的正常转移，并导致ACM结构组装不良。完成此操作后，所释放的纳米纤维或纳米结构可用于多种用途，例如分析蛋白质纤维的力学性能，或作为组织工程中的支架材料。

观看本视频后，您应能充分理解如何制备具有可调控成分、几何形状和结构的细胞外基质（ECM）蛋白纳米纤维及纳米结构。具体而言，您将掌握如何将细胞外基质蛋白微接触印刷至包被有聚赖氨酸的玻璃盖玻片上，随后通过热诱导使表面溶解，从而组装形成细胞外基质结构。