弹性蛋白样蛋白的定向组装形成特定超分子结构及体外货物包封

用于最小细胞设计和药物递送的超分子结构的高效组装仍然具有挑战性。本文中，我们展示了可高效生成基于两亲性弹性蛋白样蛋白的超分子结构的实验方案。所介绍的组装方法能够产生多种具有可调物理化学性质的超分子结构，例如囊泡、纤维和凝聚体。

基于蛋白质膜的区室表现出相分离行为，并能够包封化学性质多样的荧光货物分子。为表达 F20E20-mEGFP 和 F20E20-mCherry，将过夜预培养物接种至主表达培养物中，使 OD600 达到 0.3。在 400 毫升无菌 LB 培养基中，于 37 摄氏度、200 rpm 条件下培养，培养基中需添加适当的抗生素。

当表达培养物的OD600达到0.5至0.8时，加入IPTG至终浓度为1毫摩尔，并将培养温度降至20摄氏度。为了表达含有非天然氨基酸的两亲性ELP，从含有适当质粒的过夜大肠杆菌预培养物中接种主表达培养物至OD值为0.3。在400毫升添加了卡那霉素和氯霉素的无菌LB培养基中，于37摄氏度、200转/分钟条件下培养。

配制100毫摩尔非天然氨基酸储备液时，将206.2毫克非天然氨基酸加入8毫升超纯水中。用3摩尔氢氧化钠调节溶液pH值，并剧烈搅拌。待非天然氨基酸完全溶解后，将pH调至约10.5，再用超纯水定容至10毫升。

使用无菌的0.22微米滤器过滤溶液，并分装至2毫升离心管中。当表达培养物的OD600达到0.5至0.8时，加入非天然氨基酸至终浓度为2毫摩尔。继续孵育10分钟。

随后通过同时加入IPTG和阿拉伯糖诱导目标蛋白及所需的tRNA合成酶的表达。将培养温度降至20摄氏度，继续表达约20小时。培养结束后，在4摄氏度、4,000 × g条件下离心40分钟，收集细胞。

将细胞沉淀重悬于含有溶菌酶和PMSF的裂解缓冲液中。冰上孵育30分钟。随后通过浸入液氮中进行两次冻融循环。

将悬浮液进行超声处理，然后在4 °C、10,000 × g条件下离心40分钟，以澄清裂解液。随后使用亲和层析纯化蛋白质。蛋白质洗脱后，于4 °C保存，以备后续使用。

向500微升ELP溶液中加入一微升荧光染料，在15摄氏度下于ThermoMixer中振荡孵育约10小时，并注意避光。为去除过量的荧光染料，将透析膜在超纯水中平衡10分钟。将膜裁剪至合适尺寸，覆盖在含有点击反应后ELP溶液的反应管开口上。

然后用无芯盖子封闭管子，将膜固定在开口处。在盖子与膜之间填充缓冲液，以防止气泡滞留。接着将反应管放入选定的缓冲液中，将其推至液面以下，并倒置。

在 4 摄氏度下透析至少三小时，每次更换缓冲液后继续透析至少三小时。对于 THF 膨胀，将均匀的 ELP 溶液对 pH 7.5 稳定的磷酸盐缓冲液或 Tris 缓冲液进行透析。准备冻干机，并将其冷却至冻干起始温度。

将透析后的蛋白质溶液分装至1.5毫升离心管中，并用带有小孔的管盖密封，以防止冻干过程中因压力变化导致样品损失。用液氮迅速冷冻样品。从液氮中取出冷冻的蛋白质样品后，立即放入冷冻干燥仪中开始冻干。

样品完全干燥后，用干燥氮气吹扫，并立即盖紧反应管管盖，避免接触空气中的水分。向冻干样品中加入纯四氢呋喃（THF），将溶液置于含冰水的水浴超声仪中处理15分钟。预热PCR仪至30至60摄氏度用于囊泡形成，或升至最高90摄氏度用于纤维形成，并准备新的反应管，加入超纯水或缓冲液。

超声处理后，将ELP/THF溶液和已准备好的水或缓冲液放入PCR仪中孵育5分钟。然后将ELP溶液分层加至水或缓冲液上方，确保两相分离且界面清晰可见，并将混合物重新放回PCR仪中。让样品在室温下冷却10分钟，随后进行针对水或缓冲液的透析，或进行荧光显微镜观察。

配制浓度为1至50微摩尔的ELP溶液，并加入10%至20%的1-丁醇。立即通过上下吹打混匀溶液。在混匀过程中，溶液的浊度应逐渐增加，表明囊泡正在形成。

为了获得较窄的粒径分布，使用微型挤出器将囊泡通过孔径为1微米的膜进行挤出。对于染料包封，将约40微升ELP溶液（溶于10毫摩尔/升Tris-HCl缓冲液）与1微升Dextran Texas Red储备液（溶于DMSO）混合，加入10微升1-丁醇，并通过装有0.25×25毫米针头的注射器反复挤出5至10次。

THF溶胀法包含三个连续步骤，根据温度的不同，会导致ELP形成不同的超分子组装体。共聚焦荧光显微镜图像显示，由BDP-R20F20组装形成的囊泡以及由BDP-R40F20组装形成的纤维状结构。1-丁醇挤出法则仅导致ELP囊泡的形成。

与THF溶胀法相比，产生的囊泡数量大约高出两个数量级。将BDP-R40F20与10%至15%的丁醇混合，通过挤出该混合物制备囊泡。通过THF溶胀法，由BDP-R40F20组装形成了不同的超分子结构。

通过调节缓冲液的 pH 值和组装过程的温度，可形成凝聚体、纤维或囊泡。组装方案中的微小失误可能导致聚集体的形成。带正电荷的染料 ATTO Rho 13 和多糖德克斯特红 3000 通过 1-丁醇挤出法被封装到由 F20R20-mEGFP 组装而成的囊泡腔内。

共聚焦显微镜图像显示，囊泡在绿色通道中，货物分子在红色通道中，成功包封则体现在合并后的通道中。同时展示了ELP两亲性分子在单个PMBC结构单元混合与组装后PMBC群体混合时的相分离和融合行为。在PMBC组装前进行混合，会导致分子在组装后的PMBC膜中均匀分布；而将已组装的囊泡群体混合，则会形成可见的红色或绿色荧光膜区域，这些区域至少可维持20分钟。

在进行该实验操作时，需注意正确的步骤顺序，以及THF溶胀法与丁醇挤出法之间的差异。按照本方案制备的ELP囊泡可作为药物递送载体，用于酶促反应平台（如体外转录与翻译），或用于合成最小人工细胞的构建。