通过基于荧光的冰平面亲和法测定抗冻蛋白的冰结合平面

以下实验的总体目标是观察由荧光标记的抗冻蛋白结合的冰晶平面。该目标通过两个步骤实现：首先培养单个冰晶，然后使抗冻蛋白结合到冰晶上。每个冰晶均通过交叉偏振器进行观察，以确认其单一性和取向。

接下来，将一块冰晶安装到温度可控的冷指上，并塑造成半球形。然后将其浸入荧光标记的抗冻蛋白溶液中，使抗冻蛋白吸附到正在生长的半球形冰晶的特定结合晶面上。在避光的低温室内，利用特定波长的光源和滤光片对结合了荧光标记抗冻蛋白的冰晶进行观察和成像，从而获得实验结果。

与现有的冰蚀刻等方法相比，该技术的主要优势在于抗冻蛋白经过荧光标记，可立即可视化观察与冰晶面结合的蛋白。通过制备温度控制在零下0.5摄氏度的乙二醇浴，并选择一个干净且能漂浮其上的金属盘，以启动晶体生长。晶体在模具中形成，使用从聚氯乙烯管切割而成的圆柱形模具，高度为三至四厘米。

每个模具的一侧应有一个一毫米宽、两毫米高的缺口。在切出缺口的环形侧面薄薄涂上一层真空润滑脂。将涂有润滑脂且带有缺口的表面密封到金属样品盘上，使缺口朝向远离样品盘中心的方向。

务必注意不要将润滑脂填入或堵塞凹槽。准备尽可能多的模具以放入平底锅中。接下来，将过滤后的脱气去离子水加入平底锅中心，位于模具外部。

注意不要引入任何气泡。当水层上升至五毫米时，水应通过刻槽缓慢进入模具。完成后，将托盘完全水平地放入乙二醇浴中。

当平底锅和水的温度降至负0.5摄氏度后，在模具外的锅中央加入一小块冰。孵育过夜，使其在接下来的三天内形成一层冰。然后将样品放回水浴中，向模具内加水。

向每个模具中加入 13 毫升 4 摄氏度的脱气去离子水。加水后每天降低一次乙二醇浴的温度。到第四天时，模具应完全被冰填满。

取出模具，并为冰晶准备一个清洁的表面。将每个模具从托盘上取下，推出冰晶。将带有模具的清洁表面放入-20摄氏度的冰箱中冷冻一小时。

处理前。当冰制备完成后，将其带入冷冻室或冷室，以确定其是否为单晶。将冰置于两个交叉的偏振器之间。

如果冰为单晶，则不应观察到任何裂纹或不连续处，且光的方向在晶体内部不应发生变化。保持偏振器位置不变，通过旋转冰样并观察透射光来确定C轴的取向。为确定A轴的方向，需用铝箔将冰样紧密包裹。

将针垂直于海轴方向定位，刺穿锡箔并插入冰中，形成一个小孔。接着，将冰置于0.5毫巴的真空环境中20分钟。待晶体取出后，在低温室内将其暴露。

观察基面上的六边形蚀刻。AAEs 穿过六角星的顶点。该晶体将沿一条与六角星相对顶点平行的直线切成两半。

为了暴露一个主要棱柱面，将晶体牢固地固定在实验台上。使用钢锯将晶体切成两半。收集切下的晶体碎片，用于安装在冷指上。

必须进一步制备冰晶以将其安装到冷指上。准备两根直径略有不同但尺寸与冷指相近的铝棒。交替使用这两根铝棒在冰晶顶部熔出一个凹腔，直至形成一个可容纳冷指的凹腔为止。将冷指冷却至零下0.5摄氏度，并将其插入冰晶的凹腔中。

将晶体固定在原位，直至其冻结在金属上。接下来，取一个半球形杯，加入约两倍于冰晶直径的、冷却至4°C的过滤去离子水。将附着冰晶的冷指浸入杯中，去除多余的水，使冰晶顶部与液面大致齐平，且冰晶不与容器接触。

将杯壁覆盖在杯子上以进行隔热，并将温度降至零下五摄氏度。静置约一小时，使冰形成半球状。准备加入荧光蛋白。

当半球体制备完成后，将冰晶从杯中取出，并将杯中的水去除。然后加入 25 至 30 毫升预冷的、含有荧光标记的蛋白质溶液，浓度为所需浓度。

在保持总体液体体积不变的情况下，再次将冰晶浸入杯中。确保晶体顶部与液面齐平，且不接触杯壁。将冷指温度降至零下8摄氏度，使蛋白质溶液在晶体中冻结两到三小时。

当蛋白溶液中形成的冰层厚度至少达到五毫米时，停止冰的生长。保持冷指装置连接状态，将冰晶从杯中取出。通过将冷却剂温度升至略高于零摄氏度，使冷指装置脱离。

等待冰晶完全融化脱落。当冰晶从冷指管上脱落时，将其平整的一面朝下放置在干净的表面上。注意不要触碰新形成的冰面。

将晶体在零下20摄氏度条件下保存至少20分钟，然后在可避光的低温室内进行荧光观察。准备带有特定波长激发滤光片的光源以激发荧光标记，并配备相机发射滤光片。为屏蔽非特异性光线，将冰块平面向下放置在光源下方，关闭室内灯光，观察被照射冰面上的荧光图案。

为了估算由抗冻蛋白结合的冰晶面，可将传统的冰蚀刻图像与相应的基于荧光的冰晶面亲和性分析图像进行比较，两者均显示由冬季比目鱼（Pseudopleuronectes americanus）产生的Ⅰ型抗冻蛋白。该技术可用于同时比较不同抗冻蛋白的冰结合模式。本例中，使用太平洋蓝（Pacific Blue）标记的Ⅲ型 NFEA FP8 和三碘化物（trixy）标记的Ⅰ型抗冻蛋白。

这是仅可视化三型 N-F-E-A-F-P 八的结果，而此图像中仅可视化了一型抗冻蛋白。两者被一同可视化。注意每个图像的 C 轴均相同。

观看本视频后，您应能够充分理解如何培养和定向单个冰晶，并利用基于荧光的冰平面亲和性分析方法，评估荧光标记的抗冻蛋白在冰平面上的结合模式。