农杆菌介导的烟草属植物瞬时蛋白表达的优化与应用

本实验的总体目标是建立一种简单、高效且可放大的瞬时重组蛋白生产方法，利用农杆菌浸润技术在植物系统中实现重组蛋白的表达。该目标首先通过优化植物生长条件来实现；第二步是用包含植物病毒组分和双元质粒的“启动载体”转化农杆菌，随后培养转化后的农杆菌用于农杆菌浸润实验。

在农杆菌浸润过程中，将植物倒置，使其地上部分浸入农杆菌悬浮液中。随后施加真空，使叶片组织中的细胞间隙内的空气被抽出。通过快速释放真空后的重新加压，导致农杆菌悬浮液被注入叶片内部。

最终，通过免疫印迹和荧光检测来验证浸润植物中重组蛋白的表达。与现有的手工浸润等方法相比，该技术的主要优势在于真空浸润法可放大用于工业规模生产重组蛋白，包括疫苗和治疗性蛋白。该方法有助于回答植物生物技术领域的关键科学问题，并进一步推动植物作为商业化重组蛋白生产替代平台的应用。

当我们发现，在土壤种植植物中扩大农杆菌过滤规模具有挑战性时，我们首次提出了这一方法。原因有多个：土壤中含有诸如病毒、细菌、线虫等污染物，此外，土壤成分和灌溉水在不同批次之间以及不同季节之间均存在差异，且土壤在储存过程中会随时间发生老化。此外，在对土壤种植的植物进行翻转时，会导致土壤滴入农杆菌培养物中，从而在渗透过程中产生不必要的污染。

本次实验操作由植物生物学与工程实验室的高级研究助理Rebecca Snow，以及Emma Gut Robin Lobe进行演示。她和来自我实验室的研究助理Adam Trevor共同完成本研究。本研究采用水培植物生长介质和营养液，以确保植物生长的一致性，并消除使用土壤进行植物培养时可能带来的复杂因素。

开始此实验步骤时，将岩棉板浸泡在植物营养液中5分钟，然后在吸足养分的岩棉表面人工播种。本研究将评估三种雪松三号烟草（Cedar three Nico Oceana）物种：两个野生型品系，分别为 Nico Oceana Benham Ana 和 Nico Oceana Excelsior，以及由 Benham Ana 与 Excelsior 杂交获得的 Nico Oceana Excela。在受控环境和长日照光周期条件下，利用水培级联系统培育这些种子来源的植株。

Nico Oceana、Bentham Miana、Nico Oceana Excela 培养四到五周，Nico Oceana Excelsior 培养五到六周。本实验所用的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）Fasion 菌株已根据随附文稿中所述方法，转化了相应的启动载体。本演示中使用了五种转化后的农杆菌菌株。

GV3101，携带报告基因绿色荧光蛋白（GFP）；GV3101，携带番茄丛矮病毒（tomato bushy stunt virus）抑制子P19的病毒基因；以及GV3101和T10，携带经修饰的载体蛋白裂解酶（lick KM）基因。在LB培养基中加入50毫克/升卡那霉素，于28摄氏度、200至250转/分钟振荡条件下，过夜培养农杆菌菌株。次日，为开展所需实验以评估利用多种农杆菌菌株进行瞬时蛋白表达的可行性，将含PBI4-lick km载体的实验室菌株及两种野生型菌株分别用无菌水稀释，配制农杆菌悬浮液，使其在600纳米处的光密度（OD600）达到0.5。

为探究在侵染前诱导农杆菌毒力基因的必要性，首先将携带P bid 4G FP载体并在LB培养基中培养的农杆菌菌液于4,000 × g、4°C条件下离心10分钟。随后重悬于MMA诱导培养基中，使600 nm处的光密度值为0.5，并在室温下搅拌2小时。为检测乙酰丁香酮是否增强瞬时蛋白表达，将携带PBI 4G FP载体并在LB培养基中过夜培养的农杆菌菌液离心，重悬于浸润缓冲液中，缓冲液含1× MS盐、10 mmol/L MES和2%葡萄糖。

将细胞悬浮液分装至四个容器中。向每种农杆菌悬浮液中加入不同浓度的乙酰丁香酮，并在室温下孵育三小时。为检测共浸润病毒沉默抑制因子对瞬时表达GFP蛋白的影响，进行混合。

将携带GFP基因的农杆菌培养物与携带病毒沉默抑制子P19的培养物按4:1的比例用milli-Q水稀释。接下来，在演示植物真空浸润时，关键是要控制真空压力以及浸润的持续时间。首先，将制备好的农杆菌悬浮液转移至真空室内的容器中。

然后将植物倒置放入稀释的农杆菌溶液中，施加50至400毫巴的真空压力，持续30或60秒。通常最佳的浸润条件为50至100毫巴，持续60秒。真空解除后，将植物从真空室中取出，用水冲洗，并在与过滤前生长相同的培养条件下培养5至7天。

为进行Western分析准备样品时，首先在侵染后4至7天（dpi），从Nico Oceana、Benham Miana、Nico Oceana Excelsior或Nico Oceana Excela植株上随机采集叶片样品，用液氮将叶片样品研磨成细粉。向每个样品中加入三倍体积含0.5% Triton X-100的1×PBS缓冲液，并将样品转移至eppendorf管中。在4°C下轻轻振荡或旋转提取样品15分钟。

离心提取物5分钟，收集总可溶性蛋白至洁净的离心管中。用1× PBS提取缓冲液将提取物稀释至适当浓度，并加入5×上样缓冲液，使终浓度为1×。将样品煮沸5分钟后，通过SDS-PAGE分离蛋白质。

将蛋白质转移至不移动的 P 转移膜后，使用兔多克隆抗 GFP 抗血清以封闭液 1:5,000 的稀释度检测 GFP。室温下轻轻振荡孵育一小时，随后用 1×PBST 20 洗涤膜三次。再与辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体以 1:5,000 的稀释度孵育一小时，用于检测 GFP。

随后，按照随附文稿中所述方法对 Western 印迹进行处理，并分析对应于蛋白质的条带强度。使用手持式长波长紫外灯观察瞬时转化植株整体的 GFP 荧光信号，通过黄色八 ES 52 滤光片，采用数码相机并设置曝光时间为 15 秒，对瞬时转化植株进行拍照成像。使用基因 snapped 软件在基因组上获取 Western 印迹分析的图像。

使用基因分析软件，基于纯化的GFP标准品绘制的校准曲线对结果进行定量分析。将尼克氏海洋本瑟姆（Nick Oceana Bentham Miana）种植于浸泡过市售肥料的洛克韦尔平板上，以确定植物生长和生物量积累的最佳条件。磷元素的存在对于尼克氏海洋本瑟姆（NICO Oceana）本瑟姆种子的萌发和生长至关重要，如图中六周龄植株所示：分别在含4.8%磷的肥料溶液和含0%磷的肥料溶液中生长的植株表现出显著差异。

通过比较农杆菌在不同培养基中生长及其浸润介质对烟草植物健康和蛋白质表达的影响，研究了GFP的表达水平。采用真空浸润法将携带PBI 4G FP质粒的农杆菌分别在三种不同培养基中培养后浸润汉氏烟草植株。YEB、AB和LB培养基中过夜培养的农杆菌，在YEB或LB培养基中培养后经低速离心并重悬于MMA诱导培养基中，或在YEB、LB或AB培养基中过夜培养后直接用Milli-Q水按1:5或1:10比例稀释，如该蛋白免疫印迹结果所示，用YEB、LB或AB培养基培养并以Milli-Q水稀释的农杆菌浸润植株后，其平均GFP表达水平与经离心后重悬于MMA培养基的处理组相比无显著差异。

因此，建议使用超纯水稀释农杆菌培养物用于植物浸润，并在后续实验中常规使用，以达到在600纳米处光密度为0.5的条件。接下来，考察了农杆菌细胞悬浮液密度及时间进程对目标蛋白表达的影响。评估了携带PBI 4G FP的农杆菌四种不同的细胞悬浮液密度，并在浸润后4天、7天和10天（即DPI）采集叶片样品，用于Western blot分析。在4天DPI时，用不同农杆菌细胞悬浮液密度浸润的植株之间GFP荧光存在明显差异；在OD600为0.05时，7天DPI未观察到GFP表达。

在细胞悬浮液浓度为601.0、0.5和0.1时浸润的植株中，荧光强度相似，但在A600为0.05时浸润的植株中，荧光强度在10天后明显较低。在用四种不同细胞悬浮液密度浸润的植株中，GFP的表达水平未观察到差异，该实验旨在增加可用于瞬时蛋白表达的农杆菌菌株多样性。

将携带载体 KBI four lick km 的七种不同农杆菌菌株对 Nicotiana Benhamiana 植物进行真空浸润。在浸润后第七天采集叶片，并通过蛋白质印迹法估测激酶表达水平。如图所示，GV3110、1A4 和 LBA4404 菌株产生的裂解酶水平最高，且三者之间差异较小。

尽管C58C1菌株的表达水平最低，但A77、AT06和AT10菌株均实现了中等水平的裂解酶生产。通过XMO Graham检测法证实了裂解酶的酶活性。纯化的细菌裂解酶蛋白被用作酶活性的阳性对照。值得注意的是，在接种后第7天（7 DPI），用A4和AT77野生型农杆菌菌株侵染的本氏烟（Nicotiana benthamiana）植株表现出病理症状，如植株矮化、叶柄伸长与卷曲以及叶片卷曲。

在接种野生型 T10 菌株的本氏烟（Nicotiana benhamiana）植株中，症状较轻。在接种实验室菌株 GV3101 的 Nico Oceana Benham 植株中未观察到症状。对野生型植株生物量生产的比较表明，在相同生长条件下，Nico Oceana Excela 产生的叶片生物量约为 Nico Oceana 的两倍。

通过农杆菌菌株GV3101（携带PBI4G F-P-G-F-P载体）浸润，检测了Nico Oceana Benham、Nico Oceana Excelsior和Nico Oceana Excela中的蛋白表达水平。在浸润后第7天（7 DPI），对整片浸润叶片中的GFP积累情况进行评估。在紫外光下对GFP表达进行肉眼观察，结果显示Nico Oceana Hamana和Nico Oceana Excela中GFP分布均匀，而Nico Oceana Excelsior中分布不均，这归因于难以完全浸润Nico Oceana Excelsior的整个叶片区域。在浸润后第7天对这些叶片进行GFP积累的蛋白质印迹（Western blot）分析，结果表明，Nico Oceana Hamana中的GFP表达水平高于Nico Oceana Excela和Nico Oceana Excelsior，表明Nico Oceana中蛋白生产的水平较低。

Excelsior 的产生是由于在采集的叶片中GFP的渗透不均匀以及分布不均所致。为了测试真空压力对叶片的影响，将携带PBI 4G FP的农杆菌菌株GV 3101在400、200、100或50毫巴的真空压力下，对Nico Oceana Benham植株进行渗透处理，真空维持时间为30秒或60秒。当使用5、100和200毫巴的真空压力处理30秒或60秒时，GFP的表达量未见差异，且对植株健康的影响轻微或无不利影响。

通过每小时接种一盘Nico Oceana Benham植物，使用携带PBI 4G FP的GV3101农杆菌（A600为0.5）进行真空渗透，持续八小时，以评估真空处理时间对目标蛋白表达的影响。在本代表性实验结果所示的同一农杆菌培养物中，长达八小时内的各个时间点绿色荧光蛋白（GFP）的产量水平相似，表明在此时间段内农杆菌保持了其释放单链DNA的能力。由于已有多种化学物质和单糖被报道可增强不同植物物种中的瞬时蛋白表达。

本研究还评估了不同浓度的乙酰苯、Crinone 和葡萄糖对农杆菌菌株 GV3101（携带 PBI4GFP 质粒）浸润的 Nico Oceana Benham 植物中瞬时 GFP 蛋白表达的影响。农杆菌在 YEB 培养基中过夜培养后，经离心并重悬至 A600 为 0.5，分别悬浮于含 2% 葡萄糖并添加指定浓度乙酰苯酮的 MMA 培养基，或含 200 微摩尔乙酰苯酮并添加指定浓度葡萄糖的 MMA 培养基中。如图所示，与对照组（诱导培养基中不含乙酰苯酮或葡萄糖）相比，这些化合物的任一测试浓度均未引起 GFP 蛋白表达的显著增加。

接下来，研究了共浸润沉默抑制因子对农杆菌介导的GFP和HAC1基因在本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片中瞬时表达的影响。含有PBI14GFP载体和番茄丛矮病毒（tomato bushy stunt virus）的病毒沉默抑制因子P19的农杆菌GV3101菌株，分别按1:1、2:1、3:1和4:1的比例混合。如接种后7天（7 DPI）的Western blot分析结果所示，在任何两种农杆菌悬浮液比例下，P19的存在均未增加或减少本氏烟中GFP的表达量。

此外，研究了两种病毒基因沉默抑制子P23和P19对HAC1转录后基因沉默的抑制作用。将携带启动载体PBI4-HAC1的农杆菌与携带两种病毒沉默抑制子质粒之一的农杆菌以4:1的比例混合，共同浸润到本氏烟（Nicotiana benthamiana）中。在浸润后3至8天采集叶片样品。

该图显示了通过蛋白质印迹分析，在三次实验中测得的 HAC1 表达水平的平均值。与在 60 dpi 时未使用沉默抑制子的情况相比，将 P19 或 P23 与 Nicotiana occidentalis Benham 共同侵染可提高 HAC1 的产量。这表明 P19 和 P23 在该系统中具有高效性。

还观察到，无论是否存在基因沉默抑制子，HAC1蛋白的表达水平均从接种后第7天开始下降。这表明，在瞬时蛋白表达过程中，用启动载体侵染的本氏烟（Nico Oceana Benham Miana）中蛋白产量下降的时间具有靶标特异性。最后，每年通过使用同一批次的农杆菌细胞库侵染本氏烟（nicotiana benham）植株，评估该农杆菌细胞库的稳定性，以检测蛋白积累情况。

这些代表性结果表明，HA1 蛋白的生产在过去三年多的时间里一直非常稳定。在本氏烟植物中，HAC1 的平均产量为 651 ± 49.4 毫克/千克。观看本视频后，您应能充分掌握如何应用农杆菌浸润技术大规模生产重组蛋白，这些蛋白可用于亚单位疫苗、治疗性蛋白抗体以及诊断用抗原的制造。

进行该实验操作时，重要的是需牢记通过水培法控制植物杂交，使用具有活性的农杆菌，控制真空压力及作用时间，并监测蛋白表达的载体。一旦掌握，若在受控条件下规范操作，农杆菌过滤法可在24小时内完成。