鉴定蛋白质中的胞间连丝定位序列 活体植株中

本实验的总体目标是鉴定目标蛋白中的胞间连丝定位信号。该方法有助于通过识别引导蛋白定位于胞间连丝的关键信号序列，解答植物细胞间连接研究中的关键问题，进而促进大分子在细胞间的转运研究。该技术的主要优势在于实验流程可靠，且易于推广应用于大多数靶向胞间连丝的蛋白中，以发现其胞间连丝定位信号序列。

该方法的视频演示至关重要，因为种植、过滤以及共聚焦观察前的样品制备步骤难以通过传统的纸质出版物学会。将本氏烟草（Nicotiana benthamiana）种子种植于湿润土壤中，并保持高密度播种。生长期间，将其置于环境控制培养室中，温度维持在20至25摄氏度，每日光照16小时，光照强度约为75 µmol/(m²·s)。

当菌丝直径达到半厘米后，小心地将幼苗转移到较大的花盆中，并在同一培养箱内相同条件下继续培养。在四周内维持植株生长，直至其发育至四到八叶期。

此时，最大的叶片直径应为四到六厘米。为便于鉴定和分析，请根据随附的文字方案选择表达系统，并对每种表达的蛋白质进行荧光标记。按照所述方法制备基于 pPZP-RCS2 的质粒，并将一微克该质粒加入 100 微升农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）感受态细胞中。

将细胞置于冰上孵育30分钟。然后，用液氮速冻细胞1分钟。接着，将细胞在28摄氏度下温育15分钟，随后向感受态细胞混合物中加入1毫升LB培养基。

加入LB培养基后，将细胞置于28摄氏度下培养两小时。接着，在3,000 × g 条件下离心一分钟。用0.2毫升LB培养基重悬菌体沉淀，并将其涂布于含抗生素的LB琼脂选择性平板上。

将细胞在28摄氏度下培养48小时，直至可见单个菌落。然后挑取多个单菌落接种至新的LB琼脂平板上，于28摄氏度继续培养48小时。接着，从每块平板上取少量细菌进行分析，采用菌落PCR确认目标双元载体构建的是否存在。

将含有目标构建物的农杆菌单菌落接种至5毫升添加了适当抗生素的LB培养基中。在28摄氏度下过夜培养细胞。然后在3,000 × g条件下离心细胞，用农杆菌浸润缓冲液重悬菌体沉淀，调节OD600至0.5。

将悬浮液在室温下孵育两小时，然后将接种物装入一支1毫升的塑料注射器中。用戴手套的手指固定一片完全成熟的N.Benthamiana叶片的上表皮，在叶片下表皮处贴紧注射器喷嘴，随后通过缓慢注射渗透培养基，将农杆菌引入叶片组织中。

将侵染后的植物保持至观察前。在侵染后24至48小时，用刀片在叶脉之间将每片叶子切成碎片。将叶片放置在载玻片上，使叶片的远轴面朝上。

然后，在叶片切片上滴加一滴水，并盖上盖玻片。用小块胶带在盖玻片两侧将其固定。将载玻片置于激光扫描共聚焦显微镜下，使用10X物镜寻找荧光信号最佳的细胞。

然后，使用 63X 物镜镜头记录图像，以进行更详细的观察。此外，使用适当的荧光光源激发表达的荧光蛋白。保留用于图像采集的所有设置，以确保实验间的一致性。

每种实验条件下，平均检测 100 至 120 个细胞。利用共聚焦显微镜图像判断被检测蛋白的定位情况。这些图像展示了烟草花叶病毒（TMV）运动蛋白全长序列与货物分子 CFP 融合后、鉴定出的胞间连丝定位信号与 CFP 融合后，以及胞间连丝定位蛋白 PDCB1 与 DsRed 共表达后，在胞间连丝处典型的外周点状定位模式。

在对照条件下，全长的烟草花叶病毒（TMV）运动蛋白与CFP融合蛋白及其在TMV运动蛋白中鉴定出的定位信号与CFP的融合蛋白均靶向胞间连丝，其亚细胞定位表现为CFP的定位情况，而标记蛋白DsRed2则呈现核质共定位。当第四个氨基酸缬氨酸突变为丙氨酸时，无论是全长的TMV运动蛋白，还是其内部鉴定出的定位信号，均丧失了靶向胞间连丝的能力。这表明该氨基酸残基对胞间连丝定位信号的结构或功能具有重要作用。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在50小时内完成。在进行该实验时，务必确保植物处于非常健康的状态，并且处于合适的叶片发育阶段。观看本视频后，您不仅应能够准确识别胞间连丝定位蛋白信号，还应掌握如何识别植物蛋白中的其他特定信号。