利用双分子荧光互补技术在烟草原生质体和叶片中可视化蛋白质-蛋白质相互作用

以下实验的总体目标是监测在完整烟草叶片中表达的两种蛋白质之间的相互作用。该目标通过设计适当的载体实现，即将两个目的基因分别与分裂的荧光蛋白片段融合，并将这些载体转化至农杆菌中。第二步是将农杆菌培养物混合后注射到烟草叶片中，从而促使蛋白表达并重建荧光信号。

如果蛋白质相互靠近，接下来可对完整的叶片或分离的原生质体在显微镜下进行分析。通过荧光显微镜检测所发出的荧光信号，可以获得显示蛋白质-蛋白质相互作用的结果。该技术相较于现有的方法（如免疫共沉淀或酵母双杂交）的主要优势在于，蛋白质-蛋白质相互作用可在活体植物细胞中直接被监测。

该方法有助于解答植物生物学领域中的关键问题，例如蛋白质复合物在不同细胞区室中的形成。开始此实验前，需培养用于转化烟草叶片的农杆菌。在无菌的50毫升离心管中，将含有目的质粒的AG L1甘油菌种50微升接种至10毫升含有适当抗生素的LB培养基中。

在28摄氏度下培养至少24小时，以190转/分钟振荡，直至次日菌液在600 nm处的光密度（OD 600）达到1.0至2.0之间。将细菌在3000 × g条件下离心15分钟。弃去上清液后，将菌体沉淀重悬于新鲜配制的侵染培养基中，并将悬浮液的OD 600调整至1.0。

将农杆菌细胞在室温避光条件下于摇床中振荡培养两小时，以浸润烟草叶片。从三周大的烟草植株上选取数片较老的叶片。混合等体积的溶液。

取每种携带目标重组质粒的农杆菌各三毫升。用五毫升无针注射器吸取细胞悬浮液混合物，用于将悬浮液注入烟草叶片。在叶片底面多个位置小心按压注射器，使液体渗入，然后给植物浇水，并用遮盖物覆盖，避免光照，静置两天。

为了从浸润的叶片中分离原生质体，首先将叶片放入培养皿中，并加入一些新配制的酶解液。使用新的剃须刀片将叶片切成约0.5平方厘米大小的片状。接着，将带有酶解液的叶片碎片转移至真空环境中。

浸润烧瓶。抽真空浸润约20秒，直至叶片中有气泡冒出。非常小心地释放真空。

90分钟后，在室温避光条件下以40 RPM转速振荡锥形瓶90分钟。以90 RPM转速振荡1分钟，释放原生质体。将溶液经纱布过滤至15毫升圆底离心管中。

用一毫升移液枪头吸取两毫升 FPCN 缓冲液覆盖在原生质体溶液上，室温下以 70 × g 离心 10 分钟，加速度和减速度均设为缓慢。完整原生质体会聚集在酶溶液与 FPCN 缓冲液之间的界面处，使用宽孔口的一毫升移液枪头将完整原生质体转移至新的离心管中。为确保本实验步骤成功，务必使用白色孔口的枪头，以防止完整原生质体破裂。

用W5缓冲液补满离心管，在100 × g条件下以缓慢加速和减速离心2分钟。为沉淀原生质体，小心移除上清液，并用约200 µL W5缓冲液重悬沉淀，具体体积根据原生质体的量而定。

为激光扫描显微镜制备原生质体样品时，首先在载玻片上相距约两厘米处各放置一条微小的封片胶条。将20微升原生质体溶液置于两条胶条之间，然后小心地将盖玻片覆盖在上方。封片胶条可防止盖玻片压碎原生质体。

为进行激光扫描显微镜观察而制备完整的叶片样品时，从叶片上剪下一厘米长的片段，将其底面朝上放置在显微镜载玻片上。加入约 30 µL 水。盖上盖玻片，并在两侧用胶带紧密固定。

使用 MICCA 公司 TCS SP5 型共聚焦激光扫描显微镜进行成像。选用 63 倍油镜物镜，以甘油为成像介质，采用 Leica 应用套件高级荧光软件进行图像分析。将氩离子激光器功率设为 30%，488 纳米激光激发强度设为 18%，用于检测其在 515 纳米处的信号，将第一 PMT 检测器的发射波长带宽设置为 495 至 550 纳米。

为了监测叶绿素自发荧光，将第二个PMT检测器的发射波长范围设置为650至705纳米。为了监测M cherry信号，使用HENI 5 61激光器。

将激光强度设置为18%，第三个PMT检测器的发射光带宽设置为587至610纳米。确保所有PMT检测器通道的图像均在相同的增益设置下采集。增益应介于800至900之间，以排除背景信号。

以1024 × 1024像素的尺寸和100赫兹的扫描速度获取此格式的图像。对于Z轴层扫，每层之间的最大间距为0.5微米。在本研究中，采用BFC方法监测细胞质分子伴侣HSP 90与膜锚定蛋白TPR seven及TPR 64之间的相互作用。

如示意图所示，Venus 蛋白连接至位于内质网的 TPR7 的胞质部分，或连接至位于叶绿体外膜的 TPR64。Hs.P90 的 N 端与 SCFP 融合，从而介导 TPR64 和 TPR7 的 TPR 结构域与 HSP90 的 C 端相互作用。单独表达的 SCFP 在细胞质中作为阴性对照，用于验证 TPR7 与 HSP90 蛋白复合物的定位。TPR7 与 HSP90 共同转化，并与内质网标记蛋白一同表达。

以完整叶片中的荧光作为对照进行监测。单独表达SCFP，并与TPR seven及内质网标记物共同表达。在所有所示图像中，比例尺代表10微米。

左侧的图示显示了在 515 纳米处监测到的绿色荧光信号的重建结果。内质网标记物显示为红色。中间图示为两种信号的叠加，右侧图示也展示了叠加结果。

观察到重建的TPR7信号与HSP90信号重叠，并与内质网标记物共定位呈现黄色。相比之下，TPR7与阴性对照CFP之间未检测到共定位信号。在下一个示例中，叶绿体蛋白Tox64与HSP90共同表达作为对照。

将 Tox 64 与 SCFP 单独共表达。同前，于 515 纳米处监测重组的绿色荧光。中间图示在 480 纳米处监测的叶绿素自发荧光。

右侧图中显示了两种信号的红色叠加。在共表达 tox 64 和 HSP 90 的细胞中观察到重建的荧光，但在仅共表达 tox 64 和 SCFP 的细胞中未观察到荧光。

由于在整片叶片的显微图像中难以准确确定tox 64和HSP 90的定位，因此从侵染的烟草叶片中分离原生质体用于荧光显微镜观察。与之前相同，在515纳米处监测重组荧光，在480纳米处监测叶绿素自发荧光，并生成叠加图像。如本叠加图像所示，tox 64和HSP 90可被检测为围绕叶绿体周围的环状结构。

观看本视频后，您应能充分理解如何设计表达载体、转化烟草叶片，以及如何最佳地观察荧光信号，以显示您所关注的两种蛋白质之间的相互作用。