基于肽段矩阵的乙型肝炎病毒特异性CD4 T细胞应答分析及HLA-DR限制性CD4 T细胞表位鉴定

在慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染中，CD4 T细胞在病毒清除和恢复者中均发挥重要作用。该方法使我们能够同时评估HBV特异性CD4 T细胞应答并鉴定HBV特异性CD4 T细胞表位。演示该实验操作的是研究助理肖建梅（Jianmei Xiao）。

以及来自比劳的技师Xing Wan。首先，使用Ficoll密度梯度离心法从血液中分离外周血单个核细胞（PBMCs），在800 × g条件下离心20分钟。然后，用巴斯德吸管收集位于粒细胞层和红细胞层之间的粒细胞。

将解冻的细胞悬液转移至15毫升离心管中，逐滴加入1毫升预热的Benzonase RPMI 1640培养基，然后缓慢加入另外6毫升。用2毫升Benzonase RPMI 1640培养基冲洗冻存管，以回收残留的细胞。随后在400 × g离心10分钟。

弃去上清液，通过轻敲离心管使沉淀松散。将沉淀轻轻重悬于1 mL温热的Bensenase NACE RPMI 1640培养基中。轻柔混匀细胞，若可见细胞团块，则通过70 µm细胞筛过滤。

使用台盼蓝和血细胞计数板计数活细胞。用含10单位/毫升IL2和10纳克/毫升IL7的完全培养基重悬PBMCs。调整细胞密度至1.5×10⁶个细胞/毫升。

然后将细胞以每孔3×10⁵个细胞的密度接种于96孔平底培养板中。向每孔加入乙型肝炎病毒或HBV来源的肽段混合物。对于背景对照孔和阳性对照孔，加入等量的溶剂。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。第3天，向培养基中添加终浓度为每毫升50单位的IL2和每毫升10纳克的IL7。第7天，更换一半培养基，加入含有以下成分的新鲜培养基：每毫升4微克肽段、每毫升100单位IL2和每毫升20纳克IL7。

第10天，轻轻吹打每个孔中的细胞7至9次，以分散细胞团块。计数活细胞数量，并将2×10⁵个细胞转移至96孔圆底培养板的每个孔中，用于HPV特异性CD4 T细胞反应分析。对于96孔平底培养板中剩余的细胞，通过弃去过量培养基，将培养液体积调整至100 µL。

然后，向培养物中补充 100 微升新鲜的完全培养基，其中包含：4 微克/毫升肽段、100 单位/毫升 IL2 和 20 纳克/毫升 IL7。在 37°C 和 5% 二氧化碳条件下继续培养细胞，至第 12 天进行表位鉴定。在 96 孔圆底板中加入 200 微升 RPMI 1640 重悬细胞，以 550 × g 离心 3 分钟，弃去上清液，洗涤细胞。

使用完全培养基进行最后一次洗涤，共洗涤两次。对于用特定肽段混合物刺激的每孔细胞，加入200微升含有相同肽段混合物的完全培养基。对于背景对照孔，加入含有每毫升1微升DMSO的完全培养基。

对于阳性对照孔，加入含有每毫升1微升DMSO、150纳克/毫升PMA和1微摩尔/升离子霉素的完全培养基。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育6小时。孵育1小时后，向培养基中加入1.37微克/毫升莫能菌素。

六小时孵育结束后，以550 × g离心3分钟。弃上清液，用200微升DPPs洗涤细胞一次，操作如前所述。对细胞表面标志物CD3、CD4和CD8以及活率标志物进行染色。

用振荡器重悬细胞后，将培养板置于4°C冰箱中孵育30分钟。用200 µL DPBS洗涤培养板一次，随后固定并透化细胞，对细胞内细胞因子TNF Alpha和Interferon-gamma进行染色，并将培养板置于4°C冰箱中孵育45分钟。再次洗涤细胞，然后将其重悬于150 µL流式细胞术缓冲液中。

然后，使用流式细胞仪获取流式细胞术数据。将致敏性B淋巴母细胞样细胞系（BLCLs）培养于T-75培养瓶中。在PBMC扩增的第12天，计数活BLCLs的数量，并将其转移至15毫升离心管中。

以350 × g离心细胞10分钟，弃上清液。用完全培养基重悬细胞沉淀。然后将BLCL细胞分装至96孔圆底培养板，每孔4×10⁴个细胞，加入80 µL完全培养基。

每毫升加入10微克的单一肽段，并设置两个背景对照：HLADR阻断的肽段孵育对照，以及DMSO孵育对照。将培养板在37°C、5%二氧化碳条件下孵育两小时。

加入终浓度为100微克/毫升的丝裂霉素C，将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。用200微升RPMI 1640培养基洗涤培养板3次，以去除未结合的肽段和丝裂霉素C，然后将细胞重悬于120微升完全培养基中，并使用振荡器混匀。在PBMC扩增的第12天，将PBMC转移至96孔圆底培养板中。

将细胞在培养板中离心，弃去上清液，并用200 µL RPMI 1640洗涤两次，操作如前所述。每孔中加入210 µL完全培养基重悬PBMCs。对于选定用于表位鉴定的PBMC孔，取70 µL细胞悬液，分别与肽段致敏的BLCLs混合，加入三个孔中，包括两个背景对照孔。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育6小时。孵育1小时后，向培养物中加入莫能菌素至终浓度为1.37微克/毫升，并用完全培养基补足每孔体积至200微升。在此代表性示例中，针对Core11肽段混合物的TNF Alpha和干扰素-γ分泌型CD4 T细胞反应低于背景值的两倍，因此判定为阴性。

同时，Core09 肽段库的反应值高于背景值两倍以上，被视为阳性。灰色背景表示具有阳性 CD4 T 细胞反应的孔，用于表位鉴定的候选肽段以红色标出。根据 TNF-α 和分泌干扰素-γ 的 CD4 T 细胞在列向肽段库中的反应情况判断，Core01 的反应率最高。该肽段库中 C1 至 15、C31 至 45、C61 至 75 以及 C91 至 105 肽段被列为候选肽段，因为包含这些肽段的行向肽段库也显示出阳性结果。

使用核心肽段库Core07、08、09和10扩增的外周血单个核细胞（PBMCs），用于鉴定这些肽段的表位。类似地，Core09在单列肽段库中具有最高的应答率。该肽段库中的所有肽段均被设为候选肽段，并使用核心肽段库Core01、02、03、04、05和06扩增的PBMCs对这些肽段进行表位鉴定。

对于使用 Core08 多肽混合物扩增的 PBMC，在用多肽 C31 至 C45 负载的 BLCL 细胞刺激后，分泌 TNF-α 和干扰素-γ 的 CD4 T 细胞频率是背景对照的两倍。因此，多肽 C31 至 C45 是经验证的 HLA-DR 限制性 CD4 T 细胞表位。由此，在完成表位鉴定后仍保留有额外扩增的 PBMC。

可以使用一组缩短的肽段来对已鉴定的表位进行精细定位。