利用仙台病毒高效制备人诱导性多能干细胞 关键词：人诱导性多能干细胞，体细胞，仙台病毒，重编程，干细胞培养

本实验的总体目标是利用仙台病毒生成人诱导性多能干细胞。首先需准备并接种成纤维细胞，以进行后续的转导。实验的下一步是用仙台病毒感染细胞。

然后将感染的成纤维细胞转移至新鲜的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上。最后一步是人工挑选重编程后的细胞。通过免疫标记和逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R），可以证实成纤维细胞已重编程为不含外源基因的诱导性多能干细胞（I PSCs）。

与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够以经济有效的方式提高重编程效率，且不会残留转基因。在本实验方案中，需准备已在含FBS的DMEM中培养的人成纤维细胞。将这些细胞接种至24孔板中用于实验，通过六倍系列稀释法接种细胞，以确定细胞贴壁的最佳密度。24孔板的每一行可容纳一组细胞的系列稀释。

因此，可在一块培养板上同时检测四种细胞类型，将稀释液孵育24小时。次日，在三种不同汇合度下选择待转导的孔：一个为高汇合度（80%至90%），一个约为60%汇合度，第三个约为30%汇合度，并在转导前一小时或更早时间进行准备。

将培养基更换为300微升新鲜的成纤维细胞培养基用于转导解冻。将仙台病毒管置于37摄氏度下孵育数秒，随后完成解冻，避免在室温下解冻。

将解冻的病毒在6,000 G离心10秒，然后置于冰上，存放在一个微量离心管中。根据待转导细胞的数量，计算并配制病毒混合液。具体计算细节请参见文本方案。

用移液器轻轻吹打，充分混匀病毒。向密度最高的细胞中加入两倍体积的病毒；向中等密度的细胞中加入一倍体积的病毒；向密度最低的细胞中加入半倍体积的病毒。

轻轻混匀培养板，置于培养箱中过夜，使反应在次日进行。将培养基更换为 500 µL 新鲜的成纤维细胞培养基。在两天后再次更换培养基，即在转导细胞的第二次换液后的第三天进行。

在含有10% FBS的DMEM培养基中，于60毫米培养皿中制备甲基细胞，每皿接种500,000个细胞，过夜培养。次日，更换甲基细胞的培养基为新鲜培养基，随后进行共培养体系的建立。首先，移除转导的成纤维细胞中的培养基，并用DPBS洗涤一次。

接着，在五分钟内向每个转导的细胞孔中加入 200 微升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA。将所有脱落的细胞收集到一个 15 毫升的锥形管中。在 1,350 ×g 下离心 4 分钟，沉淀细胞。

然后移除上清液，并用约五毫升新鲜培养基洗涤沉淀的细胞，以中和胰蛋白酶。接着在1,350 G条件下再次离心四分钟收集细胞。接下来将大部分细胞以六级连续稀释的方式接种于甲基纤维素培养基中。

根据细胞的死亡率，可能不需要进行第一次和最后一次稀释。保留部分细胞用于RNA提取，并将培养板过夜培养。次日，将培养基更换为添加了10 µM RO激酶抑制剂Y 27632的人类胚胎干细胞培养基。

为了提高细胞在随后几天内的存活率，将培养基更换为正常的未补充的人类胚胎干细胞培养基。培养一周后，开始每隔几天检查培养皿，观察是否形成类似胚胎干细胞集落的细胞团块。一旦出现此类团块，即开始监测其生长情况。

转导三周后，ES 细胞团的克隆应已准备好进行扩增。将甲醇饲养细胞接种于24孔板中，其制备方法与60毫米培养皿中的相同。在挑选任何克隆之前，将甲醇饲养细胞的培养基更换为含有10微升Y27632的ES培养基。

从培养皿中一次挑取一个菌落，将菌落转移至含有溶液的15毫升离心管中，用移液器将菌落打散。

然后用一个破碎的菌落覆盖其中一个孔。最终每个孔加入一个破碎的菌落，并尽可能多地填充孔位。

每天更换培养基，持续培养细胞，并将其扩增至6孔板，随后转移至60毫米培养皿中。通常情况下，被仙台病毒感染的成纤维细胞在5天内不会表现出任何形态学变化；此后，细胞逐渐呈现圆形，细胞核变大，细胞质减少。

该小规模实验方案包含多个可优化的参数，例如成纤维细胞密度、病毒滴度以及向饲养层细胞接种的密度。不同汇合度下进行细胞转导（以不同颜色表示）也可进行优化。与甲醇处理的饲养细胞共培养一周后，部分重编程的成纤维细胞呈现松散的类集落形态，易于挑取，而无需使用胰蛋白酶消化收集。

完全重编程的诱导性多能干细胞（iPSCs）与部分重编程的细胞可明显区分。完全重编程的细胞排列紧密，形成的克隆具有清晰的边界；而部分重编程的细胞则形成松散的细胞簇，容易脱落。

在将诱导多能干细胞（iPSC）克隆扩增数周后，应将其与H九细胞相比进行干细胞标志物染色。这些诱导多能细胞（IPCs）对多种预期的抗体呈阳性反应，包括SSEA-4、OCT-4、TRA-81和Nanog，支持其具有多能性特征。通过逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）检测，在人iPSC克隆中未观察到转基因表达。

使用针对外源性OCT4、SOX2、klf4和Cmic的10个引物对阳性对照样本进行检测，结果显示较强的转基因表达水平。观看本视频后，您应能够充分理解如何将体细胞重编程为诱导性多能干细胞，以及如何从中筛选出完全重编程的细胞。