线性扩增介导PCR——遗传元件的定位与未知侧翼DNA的表征

以下实验的总体目标是确定整合型病毒载体在基因组中的精确位置。该目标通过初始的线性PCR反应实现，该反应使用生物素标记的引物，在固相上通过一系列反应从基因组DNA中富集载体-基因组连接序列，从而生成两端均含有已知DNA序列的双链DNA产物，进而实现对载体-基因组连接区域的指数级扩增。随后，将测序接头引入线性PCR产物中。

为了通过深度测序对未知的侧翼DNA进行测序和表征，这些片段可揭示载体整合的精确位置。该方法通过凝胶电泳显示出多种扩增的连接片段。此技术可深入了解临床基因治疗患者中病毒载体整合位点的分布情况。

该方法还可应用于其他研究，如插入突变、诱变筛选、病毒感染、癌症、干细胞克隆性或T细胞多样性分析。本实验步骤将由本实验室的技术员ina RA进行演示。进行此操作时，首先准备连接子片段：在微量离心管中混合两种LCO引物各40微升、110微升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）以及10微升氯化镁。接下来，将混合物置于95摄氏度的加热块中孵育5分钟，然后缓慢冷却至室温，过夜。

第二天，向已制备的双链接头DNA中加入300微升水，并将其转移至微量离心管过滤装置中进行过滤。离心收集浓缩的接头DNA于滤管底部。随后，从过滤装置中回收滤管底部的产物。

向离心管中加入 80 µL 水，并用移液器将 10 µL 等分试样加入 PCR 管中。使用 PCR 在 50 µL 反应体系中对羔羊的载体基因组连接区进行预扩增。

每个50微升反应体系中加入1纳克至1微克的样本DNA。对于NR羔羊，需使用至少100纳克的DNA。PCR反应体积不得超过25微升，并依据文中表二执行PCR程序。

完成之后，向每个反应中再添加0.5 µL的tech，并再次运行PCR程序。首先，准备磁珠：将20 µL链霉亲和素包被的磁珠加入一个1.5 mL离心管中，置于磁珠分离器上，室温放置1分钟。

然后弃去上清液。将磁珠重悬于 40 µL 含 BSA 的 PBS 中，并将磁珠再次置于分离器上静置 1 分钟。用 20 µL 3 M 氯化锂溶液洗涤，替换上清液。

再次将磁珠置于分离器上静置一分钟，随后用50微升6摩尔/升氯化锂溶液替换上清液。然后将磁珠混合物加入PCR反应产物中，于室温下轻轻振荡孵育2小时至过夜。

生物素标记的DNA、试纸条和包被的磁珠将形成复合物，可在4摄氏度下保存长达四天。由于LAMP（环介导等温扩增）具有高灵敏度，请继续进行LAMP或NR-LAMP实验。但如果操作不当，LAMP-PCR容易受到污染。

这是一个PCR级的环境，清洁工作需格外注意，至关重要。为了在不污染样本的情况下成功扩增未知的侧翼DNA，首先将复合物置于分离器中一分钟，然后将DNA磁珠重悬于100 µL水中。

接下来，将复合物暴露于分离剂中一分钟。此次将DNA磁珠复合物重悬于以下混合液中：8.25 µL 水、1 µL HEXA 核苷酸缓冲液、0.25 µL dNTPs 以及 0.5 µL cano 聚合酶。

将该混合物在 37 摄氏度下孵育 1 小时。然后加入 90 微升水，并将反应液置于分离装置中再暴露 1 分钟。随后将 DNA 磁珠复合物重悬于 100 微升水中进行洗涤。

继续使用分离器一分钟，并准备限制性内切酶反应。去除上清液后，加入8.5 µL水、1 µL限制性内切酶缓冲液和0.5 µL限制性内切酶。

选择限制性内切酶时，需确保该酶在预扩增反应所用引物结合位点内及下游区域均无识别位点。在最适温度下孵育反应一小时后，加入90 µL水。离心分离一分钟，用100 µL水洗涤并重悬BDNA复合物。

重复分离步骤，并准备连接反应。向磁珠中加入5 µL水、1 µL 10× fast link缓冲液、1 µL TP、1 µL fast link DNA连接酶以及1 µL在实验开始时制备的接头盒（linker cassette）。

在室温下使该反应进行五分钟。加入90 µL水并分离磁珠以终止反应，随后用100 µL水洗涤一次。再次分离后，为使合成的DNA变性，将磁珠重悬于5 µL 0.1 N氢氧化钠溶液中，并在室温下振荡混合物五分钟。

然后将复合物分离一分钟，并收集上清液，其中含有前体扩增的载体基因组连接片段。立即进行指数扩增，或于-20摄氏度保存。首先使复合物暴露于分离剂中一分钟。

将DNA磁珠重悬于100微升水中，再次分离后弃去上清液。进行连接反应时，加入6.5微升水、1微升circ Ligase和10倍反应缓冲液。

加入0.5微升氯化镁、0.5微升TP、1微升SS连接子寡核苷酸以及0.5微升环状连接酶。在60摄氏度反应一小时后，使用磁珠分离器，加入90微升水终止反应，并用另外100微升水将磁珠重悬，再次使用分离器，将洗涤后的复合物收集于10微升水中。首先，按照文中表三所述配制PCR主混合液。

在200微升PCR管中，向2微升羔羊肉或NR羔羊肉样品中加入48微升混合液，按文中所述条件进行PCR扩增。准备更多链霉亲和素包被的磁珠，并将其重悬于6摩尔氯化锂溶液中。羔羊肉样品使用20微升，NR羔羊肉样品使用50微升。然后将磁珠加入等体积的PCR扩增产物中，在室温下以300转/分钟振荡孵育2小时至过夜，收集DNA-磁珠复合物，并用100微升水洗涤，洗涤方法同前文所述。

现在，将复合物悬浮于0.1 N氢氧化钠溶液中，在摇床上室温孵育10分钟。随后将磁珠置于分离器上1分钟，收集含有扩增DNA的上清液至新的离心管中。以扩增得到的DNA为模板，取2 µL按文中表四所述条件进行PCR扩增。

通过凝胶电泳观察产物以纯化产物。取40微升产物与44微升室温的am pure XP磁珠混合，孵育5分钟。然后将磁珠置于磁力架上分离2分钟。

去除上清液后，用200微升70%乙醇洗涤磁珠两次，然后将磁珠重悬于30微升水中，并加入40纳克DNA融合引物。可采用PCR添加测序特异性接头。具体细节见表五。

在凝胶上检测产物。通过高分辨率凝胶电泳观察羔羊PCR结果是相比较而言最佳的诊断分析方法。虽然2%琼脂糖凝胶也可使用，但效果不如前者。

NR LAMB的克隆性无法通过肉眼观察PCR产物进行诊断。然而，2%琼脂糖凝胶完全足以确定该实验方案是否成功。在对PCR产物进行测序后，即可确定载体在宿主基因组中的位置。

根据这些数据，可以在编码区以及转录起始位点附近记录插入位点的位置。该技术的发展为基因治疗领域的研究人员探索基因转移载体在临床前模型以及临床基因治疗试验中的生物安全性铺平了道路。