一个 体外 单分子成像分析帽依赖性翻译动力学实验方法

本方案具有重要意义，因为它能够利用现有的无细胞翻译系统，实现对活性真核翻译的单分子分析。该技术的主要优势在于，它可保留整体翻译特性，提供单分子分辨率，并且相对容易从其他整体翻译检测方法中进行改造和应用。该方法可适用于任何已在整体条件下被证实能够有效支持帽依赖性翻译的无细胞翻译系统。

演示该实验步骤的是来自曲晓慧实验室的研究助理王洪云和高级研究员Anthony Gaba。在进行单分子实验前至少三小时，打开显微镜培养箱并将气流调至低速，以避免对实验造成过度的声学干扰。然后将培养箱温度设定为无细胞翻译系统所需的最适温度。

实验开始前至少一小时，按下激光器盒子后方的激光电源按钮，转动激光安全钥匙，并按下启动按钮以开启激光器。打开显微镜，选择成像模式、物镜和滤光片组。开启EMCCD相机、载物台控制器、注射泵和计算机，并启动相机、激光器、电动载物台和注射泵的软件。

在激光控制软件中，单击“连接”以设置激光强度，取消勾选快门框，然后单击“控制”以在弹出的激光控制窗口中拖动强度滑动条。输入穿透深度以将激光设置为所需角度，并确认快门框已关闭，以便在不进行成像时使激光保持关闭状态。当相机冷却并稳定至其指定工作温度后，在相机软件中选择“动力学”作为采集模式，并输入曝光时间、动力学序列长度以及电子倍增增益值参数。

选择保存数据图像文件的目录并指定文件名。将注射泵设置为中等至较快的流速，向微量离心管中加入 500 µL 70% 乙醇。将注射泵管路末端插入乙醇溶液中，使用注射泵软件在抽取和排出模式之间切换，用乙醇冲洗管路三次，再用无 RNase 水冲洗三次。

最后一次水洗后，将管路末端轻触干净的擦拭纸，以去除管内残留的水分，并将管路末端插入干净的微量离心管中。对于3'端生物素标记的mRNA固定，将流动池放入显微镜样品架中，使盖玻片一侧朝下，并用胶带固定流动池。用胶带封住未使用的流道入口和出口，并向流道中加入1.5倍体积的200微克/毫升链霉亲和素溶液。

室温孵育10分钟后，用T50洗涤缓冲液以每次洗涤三倍于通道体积的用量，用折叠的实验室擦拭纸洗涤并擦干通道三次。最后一次洗涤后，在显微镜物镜上滴加一滴浸油，将样品 holder 和样品室放置在显微镜载物台上。然后将物镜缓慢靠近盖玻片，直至物镜上的浸油与盖玻片接触，并移动样品载物台，使流动通道的位置正对物镜镜头下方。

在显微镜控制触摸屏上，选择“对焦”选项卡，然后点击“对焦搜索”并开始。当成功达到对焦平面时，会听到一声蜂鸣声。在相机软件中，选择实时模式。

在激光控制软件中，打开激光快门并调节激光强度。在显微镜控制触摸屏上，以实时模式观察荧光图像，并使用微调步进控制调节物镜位置。在相机软件中，移动载物台以评估流道检测表面不同区域的荧光背景水平。

如果荧光信号较弱，停止活体成像模式，在激光控制软件中关闭激光快门，并用两倍于流道体积的生物素化 mRNA 溶液替换流道中的洗涤缓冲液。15 分钟后，每次使用三倍于流道体积的翻译兼容缓冲液，洗涤流道三次。对于单分子检测，取三倍体积的新鲜解冻翻译反应混合物（不含 mRNA），加入优化浓度的荧光标记抗体，在冰上的微量离心管中混匀，短暂离心以使混合液沉降至管底。

将翻译反应混合物转移至700微升微量离心管管盖内表面，将注射泵设置为吸取模式。将泵管末端插入翻译反应混合物中，启动注射器吸取。当翻译反应混合物完全进入泵管后，停止吸取操作，将注射泵设置反转至 dispensing 模式，并将流速调节至适合输送翻译反应混合物的最佳速率。

根据需要启动和停止注射器，使翻译混合物到达管路末端，并将泵管末端插入流动通道的入口，注意避免产生气泡。将定制的金属支架拧紧到显微镜样品 holder 板上以稳定连接，并调整显微镜焦距和成像区域的荧光。确认影片采集参数设置正确，并已输入适当的文件名和保存路径用于存储文件。

移动载物台，使成像区域位于流动通道检测面的中心位置。在连续 AF 选项卡下，点击开始按钮。当成功达到焦平面时，会听到一声蜂鸣声。

降低环境光后，打开激光快门，点击“采集信号”按钮开始记录。五秒后，输入运行命令，将翻译混合物注入流动通道。随后以每帧0.5至2秒的时间分辨率记录数据，持续时间最长可达两小时。

为了分析Cy3 ANTI-FLAG结合事件，对整个视频中选定的Cy3抗FLAG斑点的荧光强度逐帧进行计算，并连接形成强度轨迹。原始轨迹可能显得嘈杂，可能需要使用非线性前向/后向滤波器来降低背景噪声。可通过步进检测算法对轨迹进一步优化，实现轨迹的数字化。

抗体与新生多肽结合会导致荧光瞬时增强，而抗体与多肽解离则会引起荧光瞬时减弱。荧光素酶 flag mRNA 的停留时间直方图符合对数正态分布，得出的肽链合成速率为每秒 2.5 ± 0.1 个氨基酸。首次到达时间直方图符合偏移的对数正态函数，表明单个 mRNA 翻译活性具有高度异质性。

如直方图所示，在单个荧光素酶flag mRNA分子上，首次肽链合成事件最早可在翻译混合物加入后两分钟开始，最晚可达20分钟。与使用荧光素酶flag mRNA的翻译相比，发夹结构荧光素酶flag mRNA翻译的首次到达时间直方图显示出抗体结合速度较慢。然而，利用这些相同mRNA在无细胞翻译反应中进行的整体发光测量，并不能分辨翻译动力学的差异。

该检测方法的单分子分辨率可提供有关帽依赖性翻译的更多动力学信息，而这些信息通过其他方法难以获得。真核细胞无细胞翻译体系对微小的实验条件变化非常敏感，因此在使用该方法准确检测翻译过程中的细微差异时，细节把握和操作一致性至关重要。