成年斑马鱼肾脏肾单位组成与功能分析

以下实验的总体目标是评估成年斑马鱼肾脏中肾单位节段的组成和功能。首先通过向斑马鱼体内注射荧光标记的葡聚糖，随后取出并固定肾脏组织，以备后续标记方法使用。

接下来，将肾脏进行漂白以去除色素，然后对目标肾单位节段进行荧光标记染色。通过免疫荧光、显微镜观察和/或明场成像获取结果，根据所选的一种或多种染色方法实现对肾脏解剖结构的可视化。以下标记方法有助于回答肾脏领域关于器官解剖结构的关键科学问题，并可用于研究肾单位的组成，以及评估损伤事件发生前后的肾功能状态。

这些技术的应用可拓展至成体肾脏形成过程中遗传异常的研究，也可用于慢性疾病模型中肾脏状态的评估。首先，将麻醉后斑马鱼的溶液倾倒出来，并将鱼小心地腹侧朝下放置于湿润的海绵模具上。接下来，用20微升解冻的葡聚糖储备液填充胰岛素注射器。

将针头以浅角度插入腹部腹侧中线。为避免轻微刺入器官，注射后立即稍微抬起针头，以提起体壁并形成可供注射溶液的空间。注射完成后，轻柔地将鱼放回水箱，使其从麻醉状态中恢复。

首先将麻醉后的鱼移出，倾去多余的溶液，并将其放置在组织或纸巾上。去除头部和内脏器官后，使用超细解剖针将体壁固定并展开。找到附着于动物背壁的肾脏器官。

使用精细镊子将肾脏从背壁分离。轻轻将肾脏放入含有1×PBS的5毫升玻璃小瓶中，洗涤3次，每次5分钟。用移液管取出肾脏，置于洁净的载玻片上，加入1至2滴1×PBS。

使用精细镊子将肾脏在载玻片上压平，确保无组织卷曲或翻折。可使用钨丝工具在结缔组织上做微小切口，以帮助肾脏平整放置。接下来，在一块 18 × 18 毫米的玻璃盖玻片的每个角落放置小块橡皮泥。

将盖玻片缓慢地覆盖在肾脏上，保持轻微倾斜角度。为尽量减少气泡的产生，如有必要，可额外添加一滴1×PBS，以填充盖玻片与载玻片之间的空隙。另取一组斑马鱼实施安乐死，并在固定液中浸泡过夜。

准备就绪后，使用精细镊子小心地将肾脏从背侧体壁分离，并将器官放入玻璃小瓶中。用3至5毫升含0.05%吐温的1×PBS溶液对分离的肾脏清洗三次，每次五分钟。接着，移除PBS溶液，并用3毫升5%蔗糖溶液冲洗肾脏30分钟。

此后，将溶液更换为 3 毫升 30% 蔗糖溶液，于次日 4 摄氏度条件下过夜保存。去除溶液后，将肾脏清洗两次，再加入 3 至 5 毫升漂白液。为去除肾脏器官上存在的黑色素细胞色素沉着，将玻璃小瓶置于旋转仪上，并仔细观察直至色素消失。

脱色通常需要约20分钟，但有时可能长达60分钟。如果漂白液作用时间过长，可能导致组织解体，因此建议每10至15分钟检查一次样本完整性。当肾脏冲洗液中的色素已被去除两次后，在室温下用4%PFA溶液孵育一小时。接着，移除4%PFA溶液，并用洗涤液清洗肾脏三次。最后一次清洗后，加入三至五毫升封闭液，在室温下孵育肾脏两小时。

封闭完成后，直接进入所选的染色方案。移除封闭液，用XPBS将肾脏清洗三次，每次清洗后让肾脏在一份XPBS中浸泡至少10分钟。在此期间，将肾脏转移至12孔或24孔培养板中。

用足量的工作浓度碱性磷酸酶底物溶液替换掉一份 XPBS，确保溶液覆盖样本，并将样本置于旋转器上，在室温下孵育 30 分钟。孵育结束后，用碱性磷酸酶洗涤缓冲液洗涤肾脏以终止反应。在 10 至 15 分钟内，更换洗涤缓冲液三次，每次彻底冲洗肾脏。

接下来，移除洗涤缓冲液，并将肾脏组织置于干净的玻片上。加入标记试剂盒中包含的磷酸酶封片介质。使用配备Debbie滤光片组的体视显微镜或复合显微镜观察经碱性磷酸酶染色的肾脏。

首先，通过将DBA溶于1×PBS中，配制200微升的工作浓度DBA溶液。用200微升DBA溶液替换PBS溶液，并将样本置于旋转器上，在室温下孵育1小时。孵育结束后，移除DBA溶液，并用3至5毫升的1×PBS对肾脏组织清洗3次，每次5分钟。

移除 XPBS，将肾脏置于干净的载玻片上。如前所述，使用荧光体视显微镜或复合显微镜上的标准 Trixie 或 Texas red 滤光片组观察经 DBA 染色的肾脏远端节段。在此未漂白肾脏的明场图像中，黑色色素沉着对应于分散分布的黑色素细胞。

此处显示的是右旋糖酐注射后三天的肾单位近端小管段的可视化图像。插图为单个带有黑色素细胞的肾单位图像。该图像显示了去除黑色素细胞色素沉着后的成年肾脏。

这些代表性图像显示了近端小管（PCT）节段之间轻微的形态学差异，而许多肾单位的近端小管紧密盘绕。其他肾单位包含盘绕程度较小的近端小管区域。蓝葡聚糖、荧光黄和荧光红葡聚糖均优先标记肾脏肾单位中的近端小管节段。然而，蓝葡聚糖和荧光黄均表现出一定程度的非特异性标记，其中荧光黄处理的肾脏中背景信号明显更高。相比之下，荧光红葡聚糖显示出显著降低的背景信号，且对近端小管的标记强度高。

通过染色检测成年肾脏中近曲小管（PCT）转运细胞类型特定标志物，可观察到具有右旋糖酐摄取特征的表达模式，包括多个紧密盘绕的PCT环状结构域，以及直径较宽且更为伸长的PCT区段。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在成年斑马鱼肾脏中成功标记肾单位节段，例如使用碱性磷酸酶标记近端小管，以及使用DBA标记中段远端小管。请注意，使用4%多聚甲醛具有极高危险性，在操作过程中务必采取防护措施，如穿戴实验服、手套和护目镜。