利用荧光清除实验评估斑马鱼肾功能

本实验的总体目标是在斑马鱼中建立一种定量的肾功能检测方法。首先，将72小时受精后（HPF）的斑马鱼胚胎进行麻醉处理。随后，将胚胎转移至注射模具中，并调整其方向，使心脏位于视野的左侧。

然后向心包腔注射一种罗丹明标记的荧光染料，并使用落射荧光解剖显微镜对心脏区域进行荧光成像。最终，通过落射荧光显微镜评估肾脏对荧光染料的清除情况。该技术的主要优势在于，无需进行血液或尿液检测（这在斑马鱼中无法实现），即可定量评估斑马鱼肾脏功能。

该方法为评估斑马鱼疾病模型中的肾功能提供了一种强有力的工具。根据文本方案制备针头并制作模具后，首先将用鱼水配制的2%琼脂溶液倒入90毫米的培养皿中以浇铸模具。将模具置于培养皿上，使叠放的载玻片边缘以一定角度浸入琼脂表面下方。

静置30分钟。取下滑片模具，使用含有三卡麻醉剂的新鲜鱼水，按1:25的比例稀释。覆盖已印有图案的载玻片，以进行斑马鱼荧光染料注射。

使用标准的显微注射装置，该装置由连接至压力调节系统的空气压缩机构成，压力调节系统接入一个直式移液管持具，用于外径为1.0的毛细管。移液管持具应安装在MN 33紧凑型装置中。通过磁性支架将三轴控制的显微操作器固定在钢制底板上，并配合解剖显微镜使用，以观察、操作和注射胚胎，同时按照文本方案中所述的标准条件维持斑马鱼的培养。

根据实验需求选用野生型或转基因斑马鱼品系。每8升水体中饲养15条雄鱼和15条雌鱼，以维持适当的养殖密度，确保获得最大数量的卵，同时避免对鱼类造成干扰。在收集卵的前一天晚上，将繁殖用鱼缸浸入野生型种鱼饲养缸中。

在收集当天，让鱼类产卵持续30至40分钟。然后使用网筛和新鲜的水族箱水收集并冲洗卵子。将清洗后的卵子放入含有胚胎培养基的90毫米培养皿中，并在28.5°C下孵育，以抑制成肌作用。

受精后8小时（hpf），将存活的胚胎用少量液体转移至含有1/100 PTU胚胎培养基的新培养皿中，并在28.5°C下继续孵育。

使用尖头镊子折断针头末端。然后通过将脉冲持续时间调至分钟档位，将 RD 移动至针尖。当溶液到达针尖时，切换回毫秒档位。

将显微测微尺置于显微镜载物台上，通过调节压力调节器和微调针尖，使排出液滴的直径调整为100微米，或体积为0.5纳升，然后再进行注射。准备两个35毫米的培养皿，每个培养皿中加入5毫升胚胎培养基，分别标记为“trica”和“恢复”。

向标记为 trica 的培养皿中加入 200 微升的 trica 原液。准备注射时，选取一个 72 小时后受精（HPF）的胚胎个体。转移极少量液体至 trica 培养皿中，并监测胚胎的活动情况。

胚胎麻醉后，将其转移至注射模具中，并在槽内调整方向，使左侧朝上，将心脏置于视野的左侧。为将RD注入心脏，需用针头刺穿心包膜，向心包腔内注入一纳升的RD。

拔出注射针后，将注射过的胚胎连同尽可能少的液体转移至恢复皿中，并观察一分钟。随后将单个胚胎转移至含有1毫升含PTU新鲜胚胎培养基的24孔板中，并做好相应标记。每实验组至少注射10个胚胎后，于28.5°C条件下孵育三小时。

注射后3小时（HPI），按照先前所述方法麻醉胚胎，并转移至含有3%甲基纤维素的35毫米培养皿中。轻轻将胚胎推入甲基纤维素中，并调整方向，以便对侧侧面进行成像。

使用570纳米的紫外光发射滤光片，获取胚胎的图像。将胚胎放回指定孔中前，使其恢复一段时间，然后对所有显微注射的胚胎进行成像，并继续在28.5°C条件下孵育。在24小时后（HP）获取第二轮图像后，我使用ImageJ软件通过打开图像并指定感兴趣区域（ROI）来定量分析每个显微注射胚胎的荧光强度。

选择编辑选区，将其大小设置为100平方像素。将心脏置于ROI的中心，然后选择分析、设置测量值，并将测量参数设置为包含平均灰度值和面积。随后进行测量，对每个胚胎在感染后3小时和24小时的每组图像定量荧光强度，并将平均灰度值导入电子表格以进行后续处理。

使用适当的软件进行统计分析，并采用如本实验所示的学生t检验（student's T-test）比较各组之间的统计学显著性。将RD注射到bbbs九条经过Morpho注射的鱼中，导致40%的胚胎在受精后五天出现腹侧囊肿。此外，与对照组相比，Morphin鱼在24 HPI后清除荧光染料的能力下降。

每组10条鱼必须在15分钟内完成注射。观看本视频后，您应充分了解如何利用斑马鱼的光学透明特性，通过定量监测显微注射的荧光染料随时间的清除情况，从而有效评估斑马鱼肾脏功能。