多模态光学显微技术揭示加勒比造礁珊瑚息肉组织的形态与结构

以下实验的总体目标是对一到两毫米厚的珊瑚虫进行三维成像，以了解其精细结构以及珊瑚色素及其定位情况。首先将样品包埋在石蜡中，然后使用切片机将其切成一微米厚的切片。接着，采用自行设计的连续块面成像技术对珊瑚虫进行成像，并重建三维图像。

通过使用多幅二维图像，获得的结果展示了该技术在不破坏珊瑚组织结构完整性的前提下，解析其精细结构细节的能力。演示该实验流程。今天将由我的研究团队合作者毛恩德·希瓦古鲁博士进行操作。

在玻璃烧杯中，将3.6克牛脂薄片置于加热板上熔化，以制备预过滤蜡液。随后，加入400毫克苏丹红四号（Sudan IV）以减少蜡的背景荧光，充分混合并静置，直至形成红色半透明溶液。

然后加入81克石蜡并充分混合。随后加入15克白色颗粒状VI棒，在同一烧杯中完全熔化。熔化后再次搅拌，得到完全混合的石蜡溶液。

现在将混合物加入玻璃瓶中，并用瓶盖 loosely 盖紧。将玻璃瓶置于 60 °C 的对流烘箱中，以保持成分处于液态，并确保所有浸润过程充分进行。该溶液可配制至 200 mL，并分装为两个 100 mL 的瓶装。

一份用于渗透，另一份用于最终包埋。加勒比海造礁珊瑚样本从AU采集，并在野外用多聚甲醛固定。为了将珊瑚组织包埋以进行SBFI成像，首先清洗在野外采集的珊瑚息肉，并将其在多聚甲醛中于4摄氏度保存。随后，当准备成像时，用PBS清洗三次，每次五分钟。

将息肉置于Ex Cal Two溶液中脱钙24小时，或直至息肉完全去除碳酸钙。将多个脱钙后的珊瑚息肉作为一个整体，依次在25%、50%、75%和100%乙醇中孵育，随后放入二甲苯中处理一次。每次处理持续30分钟，以完成样品的脱水。

接下来将处理好的息肉放入100%二甲苯中，在65°C的烘箱中孵育30分钟。随后更换为新鲜溶液，再孵育30分钟。

将息肉调整为顶部朝下，表面尽可能平放。配制二比一、一比一和一比二的二甲苯替代物与预过滤石蜡溶液。

将珊瑚息肉放入50毫升Falcon管中，依次与这三种浓度递增的预过滤石蜡孵育，随后再分别在100%预过滤石蜡中孵育三次，每次30分钟至1小时。现在将样品转移至包埋石蜡中。30分钟后取出包埋石蜡，更换为新鲜的包埋石蜡，并在65°C下继续孵育至少4小时。

随后，对组织块进行拍照。这是必要的，因为在包埋于石蜡中后，由于包埋用的红色石蜡不透明，样本的位置将变得不可见。接下来，在新的预热不锈钢包埋模具周围放置少量高熔点石蜡滴，并使其冷却。

从第二份熔化的包埋蜡中倒入少量新鲜熔化的蜡，迅速将珊瑚息肉朝下放置在白色蜡点上方。然后将塑料样品托置于不锈钢托盘上，再倒入更多包埋蜡，使蜡液上升至塑料模具的表面。随后将整个装置从65°C的烘箱中取出，置于实验台或冷却表面上冷却，直至蜡完全凝固。

随后，将干燥的组织块置于 4 摄氏度冰箱中避光保存，以备长期储存及切片。首先修整组织块，然后切取 1 微米厚的切片。使用切片机捕获包含样品的平整组织表面图像。

每次操作时，当切片被移除后，样本会在白色石蜡开始消失时显现。随后使用单色相机配合合适的荧光滤光片拍摄图像，以捕捉色素细胞或珊瑚息肉的自发荧光图像，每个样本采集三至四个脱钙的岩心样本。

进行双光子荧光成像时，将清洗后的珊瑚息肉样本倒置放入含4%多聚甲醛的带盖玻璃底培养皿中，使用双光子激光在780纳米激发波长下，通过10倍物镜以两种不同放大倍数对三至四个息肉进行成像。接着，采用拼图扫描模式，在XY方向上以10或20微米的间隔，每个焦平面采集约25至100张图像。然后在Z轴方向上以10或20微米的间隔采集50至100张图像，每个珊瑚息肉总共采集约5,000至10,000张图像。

在此图像之后，选取三到四个息肉区域，以代表一个核心及珊瑚物种。然后将所有图像以原始数据格式存储在系统的硬盘中。在此步骤中，使用方形裁剪工具对二维数据进行裁剪，通过聚焦单个息肉来减小文件大小，并将其整合为单个 TIF 文件。

在采集软件中，于 EMERIS surpass 程序模块的体积算法项目下，打开 SBFI 数据的组装文件或双光子光学切片的拼接多层 Z 栈图像，以三维形式呈现 SBFI 数据。采用阴影投影，创建一种 ISOSURFACE 模式，通过设定体素阈值生成实体表面图案。

使用剪切平面算法在 XY、XZ 和 YZ 正交模式下可视化珊瑚的三维投影，以揭示其三维结构与形态。随后，利用关键帧动画模块对投影进行动画处理。在同一 Erris 程序中，以 5% 压缩率生成视频文件，并使用体积三维和等值面模式生成 VI 格式的电影片段。

以下是来自 M Anis 和 M fa Lata 的珊瑚息肉的双光子荧光三维图像。这两幅图像在未对组分进行光谱分离的情况下，使用双光子激光在780纳米激发，并收集450至700纳米范围内的光学信号而获得；另两幅图像在相同激发条件下采集，但同时使用两个光电倍增管探测器分别收集两个组分的信号，一个为500至550纳米，另一个为650至720纳米。这些是深度编码图像。

红色代表二维图像中最浅的部分，蓝色代表最深的部分。是的。在进行该操作时，重要的是要记住正确制备包埋在红色石蜡中的样品。连续块面成像与双光子荧光显微镜技术相结合，可实现对珊瑚色素沉着及细胞结构在多种物镜尺度下的分析。

观看本视频后，您应能充分理解如何处理造礁珊瑚，以及如何对它们的三维成像及其光谱特性进行分析。