利用荧光激活细胞分选技术分离石珊瑚细胞群体
2020年5月31日
珊瑚能够形成生物多样性丰富的生态系统，对人类和海洋生物都具有重要意义。然而，目前我们对许多珊瑚细胞的全部潜能和功能仍缺乏充分理解。本文介绍了一种用于分离、标记和分选石珊瑚细胞群体的实验方案。
本方案有助于在前所未有的描述性水平上实现对活体珊瑚细胞群体的鉴定与分离。该技术的主要优势在于，它能够获取此前几乎无法达到的细胞特异性水平。本次实验操作将由西尔维斯特综合癌症中心流式细胞术共享资源平台的研究助理Shannon Saigh博士演示。
为了设置用于活体珊瑚细胞分选的流式细胞仪，首先在流式细胞仪软件中打开一个新的项目模板，并在激光面板中选择适用于分析的激光器。然后，在相应的图表区域创建一个侧向散射光对前向散射光的散点图，以建立门控和分析策略。进行活体珊瑚细胞的流式细胞分析与分选时，将未染色的对照细胞样本加载至细胞仪的样品室中，并启动读取过程。
由于珊瑚细胞特别脆弱，应保持流式细胞仪的压力较低，以防止细胞裂解。在散点图中，调节光电倍增管电压，使信号点居中，然后开始记录事件。在前向散射与侧向散射散点图中，在前向散射x轴约10的4次方标记处，对细胞群设置门控。
将对照样品替换为第一个染色细胞样品，记录约 10,000 个细胞后暂停。然后圈选仅存在于染色样品组中的事件。为了分选活体珊瑚细胞，在流式细胞仪软件中选择目标细胞群后，为每个待分选的细胞群在细胞仪的收集室中放置一个含有 250 至 500 微升适当收集溶液的微量离心管。
在充分冲洗去除碎片后，开始分选目标细胞群体，收集数量可从10,000到数百万个细胞不等。每次使用新的染料、物种或分选仪时，应将至少20,000个目标细胞分选至500 µL染色液中，以便对目标细胞群进行纯度检测，并重新分析已分选的细胞，确认这些事件仍在初始分选所用的门控范围内被正确识别。对于体外研究，分选后的细胞应暂时置于冰上保存，直至转移至培养箱或无菌环境。
通过在前向散射和侧向散射图上设置门控选择，可将其他不具有珊瑚细胞相同形态或粒度的非细胞颗粒从分析中排除。通过比较未染色和染色细胞悬液的DAPI信号直方图，并圈选排除高DAPI表达的细胞，可去除死细胞。同时，可通过圈选排除远红通道中具有高信号的细胞，从而去除含有自发荧光共生虫黄藻的细胞。
经过这一迭代设门过程后，剩余的细胞代表了不含虫黄藻的完整活体珊瑚细胞群体。随后可通过检测活性氧水平和/或溶酶体含量等特征，将这些细胞分类为不同的亚群。需要特别注意的是，某些细胞比其他细胞更为脆弱，因此必须尽可能小心地进行该操作过程。
一旦分离出特定细胞，便可用于离体功能分析，例如建立细胞培养体系和构建转录组谱型。
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概述
本研究旨在增进对珊瑚细胞的理解，这些细胞对海洋生态系统中的生物多样性至关重要。作者提出了一种分离和标记石珊瑚细胞群体的新方案，实现了前所未有的细胞特异性水平。
关键研究组成部分
研究领域
- 珊瑚生物学
- 细胞分离技术
- 生态系统生物多样性
背景
- 珊瑚为海洋生物形成重要的生态系统。
- 目前对珊瑚细胞功能的认识仍然有限。
- 分离特定的珊瑚细胞群体对于进一步研究至关重要。
使用的方法
- 用于活细胞分选的流式细胞术
- 以石珊瑚为模式生物
- 识别和分离特定细胞类型的设门策略
主要结果
- 该方案可用于鉴定和分选活体珊瑚细胞群体。
- 确保分选后细胞的纯度和活性，适用于后续实验分析。
- 有助于研究亚群细胞及其功能。
结论
- 该研究提出了一种可靠的珊瑚细胞分离方法，有助于提升相关研究潜力。
- 研究结果为珊瑚生物学及生态系统健康提供了宝贵的科学见解。
常见问题
行业重要性概述
从复杂组织中分离特定的细胞群体在早期靶点验证和机制去风险化过程中仍然是一个关键挑战。荧光激活细胞分选（FACS）能够实现高分辨率的细胞分析，有助于准确预测通路特异性反应。这一能力可直接应用于需要对稀有或脆弱细胞类型进行精确功能检测和转录组分析的生物制药发现工作流程。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过分离活细胞群体进行功能验证，实现在单细胞分辨率下对治疗假设的探究。
- 操作价值：通过将活细胞亚群与碎片、死细胞及共生体相关信号分离，减少机制上的不确定性。
- 预测价值：通过为下游检测提供纯化的样本输入，明确靶点结合和通路调控情况，支持项目组合的优先级筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：可制备标准化且具有活性的细胞悬液，适用于可重复的功能检测和剂量-反应谱分析。
- 操作价值：建立门控策略，确保检测的准备就绪，并最大限度减少不同实验批次间的变异性。
- 可扩展性：能够收集足够数量的细胞（10,000 至数百万），适用于多孔筛选和组学应用。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过持续分离与疾病相关的细胞群体，推动机制研究的后续工作，从而连接发现阶段与临床前阶段。
- 生物标志物一致性：可实现对应激反应标志物（如活性氧、溶酶体含量）的染色，以关联细胞表型与功能结果。
- 基于风险调整的推进：纯化的细胞群体可提高临床前模型中的数据可靠性，减少来自异质性样本的假阳性结果。
流程与工作流整合
FACS 通过在每个阶段实现精确的细胞输入，将自身整合到从靶点假设验证到先导化合物鉴定直至临床前验证的发现连续过程中。
- 发现生物学：通过分离活体珊瑚（或类似的哺乳动物）细胞群体，支持针对特定通路的功能性假设验证。
- 筛选：提供标准化且经门控的细胞群体，提高检测的可重复性以及定量读数的可靠性。
- 分析：生成高纯度样本，实现准确的转录组、蛋白质组或代谢组学分析，用于比较不同实验条件。
- 转化研究：通过稳定制备具有活性且对刺激有响应的细胞亚群，连接早期发现与临床前验证。
- 企业级复用：作为可重复使用的平台能力，适用于所有需要亚细胞分辨率的研究项目，不受模型系统的限制。
运营与企业影响
- 科学价值：通过减少非靶细胞的干扰并实现对靶点的机制性风险评估，提高预测的可信度。
- 操作价值：通过可重复的设门策略、低压分选和保持细胞活性的收集方法，标准化样本制备流程。
- 战略价值：提供更纯净的生物学数据，改善决策判断，降低因靶点假设错误导致的后期研发失败风险。
- 项目组合影响：通过可靠的特定亚群数据支持推进标准的制定，实现基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备流式细胞术设置的专业知识，包括激光选择、电压优化以及针对脆弱细胞的散点图设门。
- 依赖于能够实现低压分选和多参数检测（前向/侧向散射、荧光通道）的仪器设备。
- 需要跨团队对染色方案、收集培养基和设门阈值进行标准化，以确保实验可重复性。
- 必须考虑不同物种或条件下细胞脆弱性的差异，需反复优化剪切应力和染色时间。
- 受限于样本制备质量；酶解或机械解离必须保持表位完整性和细胞活性，以实现准确分选。
