改进的凝胶内还原性β-消除法用于通过质谱进行全面的O-连接糖组学和硫酸化糖组学分析

本实验的总体目标是回收Olink糖链。首先通过SDS-PAGE分离糖蛋白，然后洗涤含有目标糖蛋白的凝胶条带，以实现该目的。

接下来，通过还原性β消除反应释放O-连接聚糖。最后一步是采用相位分离法对聚糖进行完全甲基化。最终，将完全甲基化的聚糖通过串联质谱分析，以检测其结构并定量其丰度。

与高效液相色谱等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够在快速相分配中分离中性和带电的全甲基化聚糖。该方法有助于回答糖科学领域中的关键问题，通过实现对从已分离糖蛋白中释放的O-连接聚糖进行全面表征。在开始本实验步骤之前，需先使用凝胶电泳分离糖蛋白。

电泳结束后，将凝胶置于玻璃板上，使用洁净的手术刀切下目标区域，以提高寡糖（OG）的回收率。将目标凝胶条带转移至另一块玻璃板上，并切成约两毫米见方的小块。使用不锈钢微型刮勺将凝胶小块转移至一支13 × 100毫米的螺口玻璃管中。

接下来，向样品管中加入1毫升25毫摩尔的碳酸氢铵（ammonium bicarbonate）或简称ambi。用聚四氟乙烯（Teflon）衬垫的螺旋盖盖紧管子后，轻轻弹击管壁以混匀内容物，然后静置10分钟。随后小心地将ambi从玻璃管中移除。

使用移液枪或玻璃移液管，向玻璃管中加入一毫升乙腈，以完全覆盖凝胶碎块。盖上管盖后，轻轻弹击管壁混匀内容物，室温静置10分钟。完成后，移除玻璃管中的乙腈。

重复上述步骤，直至亮蓝色消失，加入 2 mL 乙酸乙酯，并盖上管盖。将试管置于 4 °C 下过夜，同时进行翻转振荡。乙酸乙酯洗涤液去除后，用 2 mL 去离子水洗涤三次。

凝胶块干燥后，加入 500 微升 100 毫摩尔/升的氢氧化钠溶液，并在冰上静置 3 至 5 分钟，使凝胶平衡至有利于糖链回收的碱性条件。随后，加入 500 微升含 2 摩尔/升硼氢化钠的 100 毫摩尔/升氢氧化钠溶液，最终浓度为 1 摩尔/升硼氢化钠和 100 毫摩尔/升氢氧化钠。

轻轻混匀试管后，将样品在45摄氏度孵育18小时。孵育的前1小时内，每15分钟轻轻混匀试管一次。β消除反应完成后，将试管置于冰上，然后逐滴缓慢加入10%乙酸。

为了中和碱性，每次加入乙酸后轻轻涡旋样品管，必要时对管子进行离心，以消除气泡并防止溢出。制作小型玻璃层析柱时，使用陶瓷切割器在移液管或玻璃巴斯德吸管的尖端划痕并折断，使吸管尖端的锥形部分长度约为一厘米。将一团玻璃棉撕松后，将其推入尖端，形成树脂床的支撑。

用衣夹固定移液管柱，并将其置于玻璃试管上方。接着，用一毫升甲醇和三毫升5%乙酸洗涤含有玻璃棉的空移液管。随后，在5%乙酸中涡旋Dow X氢型阳离子交换树脂悬液。

转移足够量的树脂以在层析柱中形成1 mL的床体积，用5倍柱体积的5%乙酸冲洗柱子，并检查流出液中是否有树脂颗粒。将柱子置于一支新的16 mm × 125 mm螺口玻璃管上方，将样品加载到柱子上。收集流出液后，用至少3倍柱体积的5%乙酸洗脱糖链至同一管中。

冻干后，向干燥的样品管中加入300微升含10%乙酸的甲醇溶液。涡旋混匀后，在37摄氏度下用氮气流吹干，除去生成的三甲基酯。重复重悬和干燥步骤至少四次后，将样品重新溶解于5%乙酸溶液中。

将样品加载到已平衡的 C 18 柱后，收集流出液至一支 13 × 100 毫米的玻璃螺口管中。用 3 毫升 5% 乙酸将 OOG 糖链洗脱至同一管中。随后将样品冻干，以制备用于完全甲基化的基础试剂。

向一个洁净的 13 × 100 毫米玻璃螺口试管中加入 400 微升 50% 氢氧化钠。然后向同一试管中加入 800 微升无水甲醇。加入 4 毫升无水二甲基亚砜，涡旋混合以生成白色沉淀。

将样品在600 × g条件下离心1分钟，使沉淀成团。弃去上清液后，向沉淀中加入4毫升无水二甲基亚砜，涡旋混匀试剂。重复此步骤4次，直至基底浆液变为半透明。将沉淀的基底溶解于3毫升无水二甲基亚砜中，并用干净的巴斯德移液管轻轻吹打混匀。

接下来，向干燥的样品中加入 200 µL 无水二甲基亚砜，涡旋混匀。为重悬样品，向其中加入 300 µL 重悬的基底浆液，并立即加入 100 µL ITOM 甲烷。用聚四氟乙烯衬垫盖密封管子，涡旋剧烈混合五分钟。

为了终止永久甲基化反应，将离心管置于冰上，并加入两毫升5%乙酸。涡旋混匀后，用移液器反复吹打溶液五次，以通过蒸发减少残留的ITOM甲烷体积。此时，在涡旋和离心后，向样品中加入两毫升二氯甲烷。

将上层水相转移至一个新的13 × 100毫米玻璃试管中。重复洗涤二氯甲烷层的水相后，将第二次的水相与第一次的水相合并。当二氯甲烷相的水洗步骤重复两到三次后，用一支洁净的巴斯德移液管将二氯甲烷相转移至一支洁净的玻璃试管中。

然后在42摄氏度下，用氮气流干燥有机相。随后平衡C18柱，并将水相加载到柱上。用去离子水洗涤C18柱，再用2毫升50%乙腈将全甲基化硫酸化O-糖链（OG glycans）洗脱至新的玻璃试管中。采用纳米电喷雾离子源，以0.4至0.6微升/分钟的注射器流速，在210摄氏度下直接进样至合适的质谱仪中，分析全甲基化OG糖链。

在离子阱仪器中，通过多级质谱（MSM S）和多维质谱对来自牛黏蛋白的经凝胶内还原性β消除法释放的全甲基化Olink糖链样品进行碰撞诱导解离（CID）碎裂时，毛细管温度应用30%至40%的碰撞能量，其代表性质谱如上图所示。该谱图主要被一种来源于聚丙烯酰胺凝胶的多分散性污染物所主导。下图显示，在β消除反应之前对凝胶小块进行乙酸乙酯洗涤可消除此问题。

使用小块或大块凝胶，通过Ingel还原性β消除法从小牛颌下黏蛋白中释放出O-连接聚糖。从小块凝胶中回收的O-连接聚糖量比从大块凝胶切片中回收的高出近十倍。中性完全甲基化聚糖在有机相二氯甲烷中被回收。

尽管全甲基化的糖链会定量地分配到水相中。相分离方法的高效性和简便性极大地提高了样品通量以及后续分析的便利性。非硫酸化的全甲基化O-糖链从有机相中回收，而所有全甲基化的硫酸化糖链则从水相中回收，这有助于近似同分异构体的硫酸化与非硫酸化糖链的鉴定与表征。

这些聚糖之间的质量差异仅为0.1个单位，若不通过相位分离将两种物质在物理上分开，则很难分辨。该技术的发展使得研究人员能够深入探索组织样本、培养细胞、模型系统以及患者样本中的聚糖多样性。观看本视频后，您应能够充分理解如何成功地对糖蛋白释放出的所有N-连接聚糖进行棕榈酰化和相位分离。

通过SDS-PAGE解析。