基于开放搜索策略在Acinetobacter baumannii O-连接糖肽鉴定中的应用

本方案简化了细菌糖肽的鉴定流程，使研究人员能够识别新的糖基化事件，以及不同菌株之间用于糖基化的糖链差异。该技术的主要优势在于，它使非糖基化研究领域的专家也能够鉴定细菌蛋白质组样品中潜在的糖基化事件。开放搜索是一种普遍适用的方法，可用于鉴定多种修饰类型，而不仅限于糖基化，且可应用于任何蛋白质组样品。

为制备STB-RPS停止-流动提取小柱，使用14号钝头针从47平方毫米的STB-RPS膜上切下三个STB-RPS圆片，用于结合50微克肽段。若肽段量较大，应相应增加圆片数量。在使用SDB-RPS固相萃取小柱前，先加入150微升100%乙腈洗涤小柱，并通过离心或用注射器轻轻施加压力推动液体，以去除储存液。

接下来，用150 µL含有1% TFA的30%甲醇洗涤小柱，然后用150 µL含有1% TFA的90%异丙醇平衡小柱。平衡后，通过离心或使用注射器将蛋白质组样品加载到STB-RPS固相支持小柱上。随后，用150 µL含有1% TFA的90%异丙醇洗涤小柱，再用150 µL 1% TFA洗涤。

为从 STB-RPS 阶段尖端洗脱肽段，将 150 µL 含 5% 氨水和 80% 乙腈的溶液加入单个尖端，使用注射器轻轻施加压力，将洗脱样品收集至各个离心管中。或者，若采用离心法进行洗脱，将 150 µL 含 5% 氨水和 80% 乙腈的溶液加入所有阶段尖端，收集至洁净的微孔板中。在 25 °C 下通过真空离心干燥洗脱的肽段。

接下来，为了富集糖肽样品，制备两性离子亲水相互作用液相色谱（ZIC-HILIC）阶段尖端。使用14号钝头针从470平方毫米的C8膜上切下一小块C8圆片，并将其装入P-200吸头中形成筛板。然后，将约5毫米的ZIC-HILIC材料用50%乙腈重悬，并使用注射器轻轻加压将其加载到筛板上。

使用色谱柱前，用20倍柱体积的ZIC-HILIC洗脱缓冲液平衡树脂，保留约10微升液体在树脂上方，以确保树脂不干燥。随后，依次用20倍柱体积的ZIC-HILIC预处理缓冲液和20倍柱体积的ZIC-HILIC上样或洗涤缓冲液洗涤树脂。接着，将消化并干燥后的肽段溶解于ZIC-HILIC上样缓冲液中，使其终浓度为每微升4微克。

涡旋混匀约1分钟，确保样品充分重悬，然后在2000 ×g、25 °C条件下离心1分钟。离心后，将重悬的肽段样品加载至已平衡的ZIC-HILIC柱上，随后使用注射器轻轻施加压力，用20倍柱体积的ZIC-HILIC上样缓冲液洗涤柱子3次。最后，用20倍柱体积的ZIC-HILIC洗脱缓冲液洗脱糖肽至1.5 mL离心管中，同样通过注射器轻轻施加压力完成，然后在25 °C下通过真空离心浓缩仪干燥洗脱液。

进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析时，将样品重悬于缓冲液A中，终浓度为每微升一微克，然后将样品上样至与质谱仪联用的高效液相色谱-超高效液相色谱（HPLC-UPLC）系统，以实现糖肽的分离与鉴定。监测质谱数据采集过程，确保数据按照预设参数进行采集。为分析蛋白质组及糖肽富集样品，打开FragPipe软件，点击“Workflow”选项卡。

在工作流程下拉菜单中，选择“打开搜索”选项，然后单击“添加文件”，将待搜索的数据文件导入 FragPipe。接着，单击“数据库”选项卡，然后点击“下载”，以启动下载管理器，通过 UniProt 登录号从 UniProt 下载蛋白质组数据库。在下载管理器中，单击“添加诱饵和污染物”选项，将诱饵蛋白和污染物蛋白添加到该数据库中。

接下来，点击 MSFragger 选项卡，然后在“峰匹配”（Peak Matching）框中，将前体离子质量容差从默认的 500 道尔顿提高到 2,000 道尔顿，以识别较大的修饰。点击“运行”（Run）选项卡以定义 FragPipe 输出结果的存储位置，然后点击“运行”（Run）按钮开始搜索。在完成高置信度糖肽的指认后，识别常见的糖链相关离子，以提高糖肽的鉴定准确性。

接下来，点击 MSFragger 选项卡，将观察到的糖链所确定的增量质量分别添加到“可变修饰”（Variable modifications）和“质量偏移”（Mass offsets）部分，各质量之间用斜杠分隔。然后，将这些糖链相关的碎片质量添加到 MSFragger 的“糖基/不稳定修饰”（Glyco/Labile Mods）部分。最后，将所有与蛋白质组学研究相关的质谱数据上传至中心化的蛋白质组学数据库，例如 PRIDE 或 MassIVE 数据库。

对鲍曼不动杆菌菌株 AB307-0294 进行开放性搜索，发现两个主要的增量质量，分别为 648.25 和 692.28 道尔顿。已知 ACICU 荚膜由一个四糖 K 单位组成，其预测质量为 843.31 道尔顿。该荚膜结构与 ACICU 中最常观察到的增量质量一致。

对菌株 D1279779 进行开放搜索分析，结果显示存在多个与 203.08、794.31 和 1588.62 道尔顿相符的增量质量。利用交互式肽段质谱注释工具，对三种鲍曼不动杆菌（A. baumannii）菌株中鉴定出的糖肽进行评估，揭示了潜在的糖链相关离子。以糖链为重点的搜索策略显著增加了在三种鲍曼不动杆菌菌株中鉴定出的糖肽/肽段质谱匹配总数，其中 ACICU 菌株增加了 37%，AB307-0294 菌株增加了 117%，D1279779 菌株增加了 363%。

对于单个质谱事件，加入糖链特异性信息通常会提高观察到的Hyperscore评分，但这种提升程度高度依赖于糖链结构。进行ZIC-HILIC富集时，务必确保树脂始终处于湿润状态，因为溶剂流失可能会影响糖肽的分离效果。有关糖基化差异的数据可用于指导定点突变研究，或用于鉴定参与糖链生物合成的基因类别。

通过开放数据库搜索，我们已开始表征不同细菌属之间的聚糖多样性。研究表明，细菌糖基化现象比我们以往认为的更为普遍，且其多样性远超预期。