糖组学指导的糖蛋白质组学促进复杂肿瘤微环境中糖蛋白质组的全面分析

我们研究先天免疫系统及免疫相关疾病中的复杂碳水化合物（即聚糖），目前主要关注脓毒症和癌症。我们的工作涉及分析方法和系统糖生物学，包括糖组学和糖蛋白质组学方法，以对人类糖蛋白进行详细表征。过去几十年中，糖蛋白质组学取得了巨大进展，其发展不再受限于高质量质谱数据的缺乏。

相反，挑战在于如何从光谱数据中解读并生成生物学知识。糖组学指导的糖蛋白质组学方法使糖科学研究人员能够深入而准确地了解糖蛋白组及其与人类健康指标之间的紧密关联。糖蛋白质组学能够独特地提供针对糖蛋白组的位点特异性信息。但糖肽的比率仍然较高。

为解决这些可重复性问题，我们的糖组学与糖蛋白质组学方法通过在同一份样品中进行糖组学普查，界定糖链搜索空间的约束条件，从而实现精确的糖蛋白质组分析。最终，该方法能够更快、更准确地进行糖肽搜索。我们这种由糖组学指导的糖蛋白质组学方法，可全面绘制来自多种不同人源样本的糖蛋白质组异质性与动态变化图谱。

因此，该方法可帮助我们更好地理解疾病进展过程，并有助于发现针对多种人类疾病的新型诊断生物标志物和治疗靶点。糖组学指导的糖蛋白质组学方法使我们能够解析人类糖蛋白质组的复杂性，进而提出新的生物学问题，例如糖链结构如何影响蛋白质功能、细胞间通讯或免疫应答。该方法也引发了关于在特定疾病中糖基化模式如何以及为何发生变化的科学问题。

这些见解可能有助于发现复杂疾病中的新诊断标志物和个性化治疗方案。为了将目标蛋白固定在PVDF膜上，使用单孔打孔器，根据需要点样的样本数量裁剪膜。用甲醇润湿裁剪好的膜，然后将其转移至平底96孔板中。

当膜接近干燥时，每点加入 2.5 µL 蛋白质样品。在 20 至 25 °C 下将膜空气干燥至少 3 小时，或更佳情况下过夜，注意避免污染。向含有点样膜的每个孔中加入 100 µL 1% PDP-40 甲醇溶液。

在20至25摄氏度的PDP-40溶液中震荡培养板。五分钟后，弃去PDP-40溶液。随后，用100微升超纯水洗涤每个含有封闭蛋白点的孔，并震荡培养板五分钟。

向每个孔中加入 15 µL PNGase F 溶液。为防止脱水，在周围空孔中加入水。用透明封板膜仔细密封，并在 37 °C 下孵育至少 8 小时。

孵育后，将酶标板超声处理5分钟，以帮助附着在孔壁上的蒸发液滴聚集到孔底。将释放出的N-糖链样品转移至各自的1.5毫升微量离心管中。用20微升超纯水对每个样品孔清洗两次，抽吸后将所有残留样品合并至新的离心管中。

接下来，加入10 µL pH为5的100毫摩尔每升乙酸铵溶液，在20至25°C条件下孵育样品1小时。使用真空浓缩系统将N-糖链样品干燥。为制备自制的多孔石墨化碳（PGC-C18）固相萃取（SPE）微柱，使用注射器将C18圆片塞入10 µL移液器吸头中并进行转移。

用移液器将10微升悬浮于50%甲醇中的PGC树脂浆液加入C18 SPE微柱中。将微柱放入配有微量离心适配器的2毫升离心管中。离心管子，制备出柱床高度约为0.5厘米的PGC-C18 SPE微柱。

接下来，向微柱中加入 50 µL 含 0.1% 三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液，并在 2000 ×g 下离心 60 秒，以促进流动相通过微柱。类似地，使用 0.1% 的水相 TFA 溶液对微柱进行洗涤和活化，重复三次。将 N-糖链样品加载至各微柱中，上样体积最多可达 40 µL。

每次加入后离心微柱，重复操作直至全部样品加入完毕。用20 µL超纯水洗涤每个微柱。将微柱转移至新的1.5 mL微量离心管中。

为了洗脱N-糖链，向每个微柱中加入40微升含0.1%三氟乙酸的50%乙腈溶液。离心收集各次离心的洗脱液。在真空浓缩系统中将脱盐后的N-糖链干燥。

使用适当的软件浏览生成的LC-MS/MS原始数据。通过评估窄的液相色谱峰宽、N-糖链异构体的有效分离、高质谱准确度、分辨率和信噪比，以及高效的CID MS/MS碎裂效率，确认数据质量良好。根据单一同位素前体离子质量、CID MS/MS碎裂图谱，以及相对和绝对的PGC-LC保留时间，手动鉴定样品中的N-糖链。

对于相对N-糖链定量，生成一个转换列表，其中包含所有已鉴定N-糖链异构体的单一同位素前体离子质荷比。从所有N-糖链前体离子的提取离子色谱图中确定曲线下面积值。为制备ZIC-HILIC-C8-SPE微柱，使用注射器将C8圆盘塞入并转移至10微升移液器吸头中。

将悬浮于甲醇中的ZIC-HILIC树脂浆液加入C8-SPE微柱中。将微柱置于含有微型离心适配器的2毫升离心管中，确保微柱位于管中央。离心以制备高度约为1厘米的C8-SPE HPLC微柱。

向微柱中加入50 µL甲醇，以2000 ×g离心60秒，使流动相流经柱体。同样，用50 µL超纯水洗涤微柱三次，每次之后再用50 µL含1%三氟乙酸（TFA）的80%乙腈溶液洗涤。将用于N-糖肽富集的干燥肽混合物重悬于50 µL含1% TFA的80%乙腈溶液中，并充分混匀。

将ZIC-HILIC-C8-SPE微柱放入配有微型离心适配器的新1.5毫升离心管中。将重悬的肽混合物加入每个微柱，于2000 G离心60秒。收集穿流组分，并将每份穿流组分重新上样至同一ZIC-HILIC-C8-SPE微柱中。

随后，依次加入50微升25毫摩尔的碳酸氢铵和50微升50%乙腈，洗脱N-糖肽。将微柱转移至新的1.5毫升低吸附微量离心管中。为逐步洗脱保留的N-糖肽，向微柱中加入50微升0.1%的水相三氟乙酸，并在2000 × g离心60秒。

随后依次加入50微升0.1%的三氟乙酸水溶液、50微升25毫摩尔碳酸氢铵溶液以及50微升50%乙腈进行N-糖肽的洗脱。使用真空浓缩系统收集、合并并干燥富集的N-糖肽以及未修饰肽段的穿流组分。N-糖组学数据分析在结直肠癌组织中鉴定出76种N-聚糖异构体，其中70%为复杂型/杂合型聚糖，20%为高甘露糖型，10%为少甘露糖型。

所有N-糖链结构均通过质谱证据确认，并利用提取离子色谱图中曲线下面积值进行定量。