上皮-间质转化过程中可变剪接的检测

以下实验的总体目标是检测上皮-间质转化（EMT）过程中选择性剪接的变化。该目标通过利用一种可诱导的EMT模型来实现，该模型在人乳腺上皮细胞中表达融合蛋白Twist-ER，在他莫昔芬处理的第二步中触发细胞发生EMT。

通过使用特异性引物组进行定量逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R），分析剪接异构体的表达，从而揭示RNA水平上的选择性剪接变化。随后，通过免疫印迹法检测各剪接异构体对应蛋白的丰度，以确认剪接异构体在蛋白水平的表达。根据定量R-T-P-C-R和免疫印迹分析获得的结果，可观察到在上皮-间质转化（EMT）过程中目的基因的选择性剪接发生变化。该方法有助于回答RNA选择性剪接与EMT领域中的关键科学问题，例如EMT过程中选择性剪接的调控机制，以及该调控如何影响EMT及其相关病理过程。该技术的应用意义在于癌症治疗，因为EMT在促进肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用。

尽管该方法可为上皮-间充质转化（EMT）过程中的可变剪接提供见解，但这种针对特定异构体的MRA检测方法也可应用于其他系统，例如研究神经元分化过程中的可变剪接以及程序性细胞死亡。第一步是将表达Twist-ER融合蛋白的细胞接种至10厘米组织培养皿中，每组设两个重复；接下来，配制他莫昔芬溶液并避光保存，以诱导上皮-间充质转化（EMT）；用含有20 nmol/L他莫昔芬的培养基处理细胞，对于未使用他莫昔芬处理的对照组，则向另一组细胞中添加0.01%乙醇；在孵育两天后进行处理。

在10倍放大倍数的光学显微镜下拍照，以记录任何形态学变化。接着，用预冷的PBS洗涤细胞。将培养板一半的细胞刮入RNA裂解缓冲液中用于RNA提取，另一半刮入100微升冰预冷的RIPA缓冲液中用于蛋白质分析。按照之前所示的方法对两组细胞进行传代，并持续用20纳摩尔他莫昔芬或溶剂处理。

每隔一天重复这些步骤，直至第14天，此时经他莫昔芬处理的Twist ER细胞应呈现纺锤形的间充质形态，而经溶剂处理的对照组细胞则应维持类似鹅卵石的上皮形态。此处以一个包含四个外显子的pre-mRNA为例，用于检测外显子的包含情况。

在可变外显子三内设计一条正向引物，在邻近的组成型外显子四内设计一条反向引物，以特异性扩增包含可变外显子三的剪接异构体，从而特异性检测外显子跳跃事件。同时设计跨越组成型外显子二与外显子四连接区域的引物，该连接区域在可变外显子三被保留时将不复存在。

在组成型外显子四内设计另一条引物，以检测该基因的全部转录本，并避免扩增自基因组DNA或前体mRNA的PCR产物。准备就绪后，在两个组成型外显子内设计引物。按照标准RNA提取流程，从先前收集的细胞样本中分离RNA。通过紫外吸收法测定RNA的浓度和质量，用于合成第一链cDNA，在20微升终体积中建立逆转录反应。

在42摄氏度下进行逆转录反应1小时，随后在70摄氏度下孵育5分钟。为使逆转录酶失活以用于实时PCR，设置20微升反应体系，其中包含10微升SYBR Green预混液、0.1至1.0微升cDNA模板以及各5皮摩尔的正向和反向引物。

进行40个循环的实时PCR实验，每个样本设三个复孔。检查解离曲线，确保每对引物均仅出现单一峰。通过计算扩增曲线的二阶导数来获得定量循环值。

使用ΔΔCQ法（公式如下所示）计算诱导样品中目标mRNA相对于未诱导样品的相对含量。将用于蛋白质分析的细胞置于冰上约10分钟，然后离心并收集上清液。测定蛋白质浓度后，用SDS上样缓冲液稀释样品，并将20至40微克蛋白质加入10% SDS-PAGE凝胶中。

以20毫安电流运行SDS-PAGE凝胶电泳1.5小时。电泳结束后，在湿转系统中以85伏电压、4摄氏度条件下将蛋白质转移至PVDF膜上，转移时间为3小时。根据目标蛋白的分子量调整转移时间。

接着，用5%脱脂牛奶在室温下封闭膜30分钟至1小时。随后将膜在4°C下与一抗孵育过夜。该一抗可识别组成型外显子包被区域中的表位，并根据蛋白大小的不同同时检测Slic异构体。

同时，通过免疫印迹法监测 EMT。对于 EMT 标志物，使用 eec、ahern、γ-连环蛋白和闭合蛋白作为上皮标志物，使用纤连蛋白、N-钙黏蛋白和 menton 作为间充质标志物。

次日，用 TBST 间隔 5 分钟洗涤膜三次。接着，将膜与 HRP 偶联的二抗以 1:10,000 的稀释比例在室温下孵育 1 小时。孵育结束后，再次用 TBST 间隔 5 分钟洗涤膜三次。

最后，使用化学发光检测系统显影蛋白质，并将膜暴露于自动放射自显影胶片上。由扭转诱导的上皮-间质转化（EMT）表现为从类似铺路石样的上皮表型转变为细长的成纤维细胞样表型，表现为上皮标志物E-钙黏蛋白、γ-连环蛋白和闭合蛋白的缺失，以及间充质标志物纤连蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白的上调。此外，通过观察细胞间连接处E-钙黏蛋白定位的丧失来评估EMT。

以下是用于检测 CD44 剪接异构体的引物设计。不同颜色的箭头表示引物的位置。定量逆转录聚合酶链反应（QRT-PCR）分析结果表明，在 TAM 处理 14 天后，CD44 V mRNA 显著减少，而 CD44 s mRNA 增加。

相比之下，在 EMT 过程中，CD44 的总转录本保持不变，这与 Q-R-T-P-C-R 的结果一致；然而，CD44v 蛋白水平显著下降，而 CD44s 蛋白的表达则大幅上调。在进行该操作时，必须牢记成功诱导 EMT 至关重要。因此，必须通过多种方法谨慎验证 EMT 是否成功，例如检测细胞形态的变化、EMT 标志物的表达以及 RIN 在细胞表面的定位。

在完成本实验步骤后，可进一步开展其他方法，如剪接报告基因检测分析，以回答更多相关问题，例如：这些顺式作用元件和反式作用因子在发育完成后如何影响可变剪接的调控？该技术为RNA生物学、发育生物学和癌症生物学领域的研究人员探索正常发育及癌症转移过程中上皮-间质转化（EMT）的可变剪接调控机制奠定了基础。