利用E1A微基因工具研究mRNA剪接变化

本实验方案的总体目标是提供使用 minigene E1A2 评估全局 mRNA 剪接变化的详细指导。这是一种快速、经济且简单的工具，可用于评估目标蛋白在可变剪接调控中的功能，无需特殊处理或实验条件。首先培养稳定表达目的基因的 HEK 293 细胞。

使用0.25%胰蛋白酶EDTA消化细胞，然后将300,000个细胞接种至6孔板的每个孔中，在37°C、5%二氧化碳条件下培养24小时。24小时后检查细胞融合度，仅在细胞融合度达到70%至80%时进行HEK 293稳定细胞的转染。用移液器小心吸除细胞培养基，然后每孔加入2毫升不含抗生素的完全DMEM培养基，并将培养板放回培养箱中继续培养。

取一管转染缓冲液，加入2微克pMTE1A DNA，涡旋混匀，再加入2微升转染试剂。再次涡旋混匀，在室温下孵育10分钟。从培养箱中取出培养板，小心地将转染混合物逐滴加入。

转染后6小时，向HEK 293稳定细胞中加入四环素以诱导Nek4表达。转染后24小时，使用荧光显微镜检测细胞形态和转染效率。用移液器吸除细胞培养基，然后加入含有化疗药物的细胞培养基。

将细胞继续孵育24小时。收集RNA时，弃去细胞培养基，直接向孔中加入0.5至1毫升RNA提取试剂。若孔中细胞汇合度较高，建议使用1毫升RNA提取试剂以提高RNA质量。

用移液器将细胞充分匀浆，转移至1.5毫升离心管中。立即进行RNA提取，或在-80°C条件下保存样品。在通风橱中解冻样品，并在室温下孵育5分钟。

加入 0.1 至 0.2 毫升氯仿，剧烈振荡，然后在室温下孵育 3 分钟。在 12,000 × g 和 4 °C 条件下离心 15 分钟，收集上层水相并转移至新的 1.5 毫升离心管中。收集总体积的约 60%，但不要收集 DNA 或有机相。

加入 0.25 至 0.5 毫升异丙醇，通过倒置混匀样品四次。室温孵育 10 分钟，然后在 4 摄氏度下以 12,000 ×g 离心 10 分钟，并弃去上清液。用乙醇洗涤 RNA 沉淀两次，每次在 7,500 ×g 离心 5 分钟，然后弃去乙醇。

将离心管倒置在纸巾上以去除多余的乙醇，然后将管子敞口置于通风橱中，使RNA沉淀部分干燥5到10分钟。用15微升经DEPC处理的水重悬RNA沉淀。通过测量230、260和280纳米处的吸光度来定量总RNA并验证RNA质量。

为验证总RNA的质量，使用经1.2%的2.5%次氯酸钠溶液预处理30分钟的1%琼脂糖凝胶进行电泳。使用一至两微克总RNA进行cDNA合成。将RNA、1微升寡聚dT引物（oligo d-T）、1微升脱氧核苷三磷酸混合物（DNTP）和无核酸酶水混合，总体积补至12微升。

将反应物在热循环仪中于 65 摄氏度孵育 5 分钟。从热循环仪中取出样品，加入 4 µL 逆转录酶缓冲液、2 µL DTT 和 1 µL 核糖核酸酶抑制剂。于 37 摄氏度孵育 2 分钟。

加入1微升耐热逆转录酶，在37摄氏度孵育50分钟。在70摄氏度灭活酶15分钟。按照文稿中所述进行PCR扩增，然后将20至25微升PCR产物上样至含有核酸染料的3%琼脂糖凝胶中，以100伏电压电泳约1小时。

拍摄凝胶图像，避免条带过饱和，并使用图像处理软件对条带进行定量分析。631、493 和 156 个碱基对处的条带分别对应 13S、12S 和 9S 亚型。从软件的“文件”菜单中打开图像文件，并将其转换为灰度图像。

调节亮度和对比度，必要时去除异常噪声。使用矩形选择工具在第一条泳道周围绘制一个矩形，然后通过“分析”、“凝胶”、“选择第一条泳道”命令或使用键盘快捷键进行选中。用鼠标在第一条泳道矩形的中央点击并按住，拖动至下一个泳道。

转到“分析”、“凝胶”，然后选择“下一个泳道”。对所有剩余的泳道重复此步骤。当所有泳道均被高亮并编号后，转到“分析”、“凝胶”，然后选择“绘制泳道”，以生成每个泳道的轮廓图。

使用直线选择工具，在每个条带对应的峰底部画一条线，排除背景噪声。在所有泳道的峰均被封闭后，选择魔棒工具并单击每个峰的内部。每个被高亮的峰的测量值应出现在结果窗口中。

仅考虑对应于 631、493 和 156 个碱基对条带的 13S、12S 和 9S 峰。将强度数据复制到电子表格编辑软件中，对每个样本的这三个条带的强度求和，然后计算每种异构体占总量的百分比。绘制每种异构体的百分比，或绘制相对于未处理样本的百分比差异。

使用含有来自 E1A 的微基因的质粒，通过评估每种异构体产生的 mRNA 比例来观察其对可变剪接的影响。E1A 异构体变体的基础表达水平取决于细胞系和 E1A 表达的时间。HEK 293 稳定细胞系或含有重组位点的 HEK 293 细胞系中 13S 的表达水平高于 HeLa 细胞，但在 E1A 表达 48 小时后，13S 和 12S 异构体的表达水平相似。

经顺铂处理的细胞显示出五端S-S剪接选择的改变，倾向于促进12S的表达。该效应在稳定表达Flag空载体以及Nek4同工型一的HEK 293细胞中均有观察到。紫杉醇处理后的可变剪接变化非常微弱，但在表达Flag和Nek4的细胞中，变化方向相反。

进行该实验方案时，重要的是使用未转染和无逆转录酶的对照，以避免因内源性E1A表达而导致误判，尤其是在使用HEK 293细胞时。获得阳性结果后，可进一步评估与化疗反应相关的特定基因的可变剪接情况。当观察到某种效应时，该简易方案可引导后续研究聚焦于更为一致的信号通路，例如该蛋白在调控化疗反应中的可变剪接过程所发挥的作用。