在人类细胞中设计人工因子以特异性调控选择性剪接

本实验方案的总体目标是构建能够特异性调控特定靶标基因可变剪接的人工剪接因子。该方法有助于解答RNA加工领域中的关键科学问题，例如癌症细胞中可变剪接的调控机制及其异常调控。该技术的主要优势在于其高度的灵活性。

我们可以设计出人工因子，以促进或抑制任意给定基因中的不同类型的可变剪接。演示该实验步骤的是我实验室的研究助理黄欢和博士后钱云。野生型 PUF DNA 被用作生成定制 PUF 结构域支架的模板。

使用包含PUF序列的PCR引物，这些序列可特异性识别每个位置上的不同RNA核苷酸。针对每个PUF重复单元，使用四种不同的引物以识别各个位置上的不同碱基。在第一轮PCR中，使用所示的引物对生成四个PUF重复单元的编码序列、通用连接片段和帽片段。

在第二轮中，以上一步生成的PCR产物为模板，使用所示的引物组合扩增出编码RNA识别序列R-one至R-four以及R-five至R-eight的序列。在第三轮中，以第二轮的产物并连接四至五的片段作为模板，使用R-one的上游引物和R-eight的下游引物，扩增出不含末端帽结构的R-one至R-eight编码序列。在第四轮PCR中，以R-one至R-eight、5'端帽和3'端帽为模板，扩增出完整的PUF结构域编码序列。

开始转染HEK-293T细胞时，轻轻倒置脂质体转染试剂瓶以混匀试剂。然后每份转染反应中，在50微升低血清培养基中稀释2微升脂质体转染试剂。轻柔混匀后，于室温孵育5分钟。

接下来，在无菌离心管中，将0.4微克富含甘氨酸结构域的表达载体和0.2微克模块化剪接报告质粒溶于50微升低血清培养基中。然后，将0.4微克RS效应结构域表达载体和0.2微克PGZ-three报告质粒溶于50微升低血清培养基中。最后，在无菌离心管中，将0.4微克PGL-RS-PUF表达载体和0.2微克PEZ-1B或PEZ-2F报告质粒溶于50微升低血清培养基中。

室温孵育5分钟后，将稀释的脂质体转染试剂与稀释的质粒混合物轻轻混匀。将最终混合物在室温下孵育20分钟。然后将含有表达载体的转染混合物加入已接种HEK-293细胞的24孔板的各孔中，并在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育至少12小时。

孵育12小时后，通过胰蛋白酶消化和离心收集转染的细胞。离心后弃去上清液，每管加入0.5毫升RNA提取缓冲液。每个样本中按每0.5毫升RNA提取缓冲液加入0.1毫升氯仿。

孵育结束后，将离心管在4°C、12,000 × g条件下离心15分钟。然后将水相转移至新的离心管中。按照初始匀浆时所用RNA提取缓冲液体积的每0.5毫升加入0.25毫升异丙醇。

涡旋混匀，在室温下孵育10分钟。按照之前的方法进行离心后，RNA沉淀通常可见于管底。弃去上清液，每0.5毫升RNA提取缓冲液加入0.5毫升75%乙醇洗涤RNA沉淀。

剧烈涡旋，然后在4°C条件下以7,500 × g离心5分钟。离心后，弃去上清液，将RNA沉淀在空气中干燥。用50微升无RNase的水溶解RNA。

接下来，向每份50 µL的RNA溶液中加入2 µL浓度为5单位/µL的DNase I、7 µL 10X缓冲液以及11 µL水。孵育后，将溶液在70 °C加热15分钟以灭活DNase。对每个样品进行逆转录反应合成cDNA后，按照屏幕上显示的顺序，将标记为“PCR反应”的各组分加入PCR管中。

每个样品准备一个反应。在热循环仪上运行RT-PCR程序。最后，通过含TBE缓冲液的10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物。

使用荧光扫描仪观察产物，并通过密度测定软件测量每种剪接异构体的含量。为了通过免疫荧光实验检测细胞凋亡，制备含有富含甘氨酸结构域表达质粒的转染混合物（如前所述），并将该混合物转染至生长于六孔板中经多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片上的 HeLa 细胞。转染后 24 小时，用 1 毫升含 4% 多聚甲醛的 1× PBS 溶液在室温下固定盖玻片上的细胞 20 分钟。

然后用 2 毫升 1x PBS 轻柔清洗盖玻片上的细胞，持续 5 分钟。接着用含 0.2% Triton X-100 的 1x PBS 处理细胞，透化 10 分钟。之后如前所述，用 1x PBS 洗涤三次，每次洗涤后以含 3% 牛血清白蛋白的 1x PBS 封闭非特异性结合位点，持续 10 分钟。

将 Flag 抗体用含 3% BSA 的 PBS 稀释至 1:1,000，取 30 微升稀释后的 Flag 抗体滴加到 Parafilm 膜上。用镊子取出盖玻片，用实验室擦拭纸小心吸去多余的缓冲液，然后将盖玻片细胞面朝下放置于抗 Flag 溶液中。

室温孵育1小时。孵育结束后，向盖玻片的细胞面加入约500 µL的1×PBS，使其漂浮于液面上方。然后将其放回六孔板中，孔内已加入1×PBS。

将盖玻片置于封口膜上，与之前相同孵育二抗15分钟。按前述方法洗涤，然后使用含DAPI的封片剂将盖玻片封于载玻片上。用荧光显微镜观察细胞，并用数码相机拍照。

通过免疫荧光显微镜观察，许多表达Gly-PUF-531的细胞显示出核DNA断裂，表明这些细胞正在发生凋亡。作为对照，表达Gly-PUF野生型的细胞与转染Gly-PUF-531的细胞相比，其核DNA断裂程度较低。此处利用抗flag抗体进行免疫荧光显微镜检测，并与DAPI染色的细胞图像合并，显示Gly-PUF-531主要定位于转染细胞的细胞核内。

Gly-PUF 野生型也在转染细胞的细胞核中定位，这表明当完全剪接的 mRNA 被转运到细胞质中时，这些 ESF 会从其靶标上解离。具有断裂核 DNA 的凋亡细胞百分比是通过随机选择的荧光显微镜图像视野进行测量的。一旦掌握，若操作得当，可在两天内完成具有 RNA 结合特异性的 PUF 支架的构建。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何通过设计人工因子在人类细胞中特异性调控选择性剪接。