人子宫颈管样本的采集、分离及流式细胞术分析

本实验的总体目标是利用细胞刷从宫颈刮片样本中分离单个核细胞。分离后的细胞可用于多种检测，包括流式细胞术，以确定女性生殖道免疫细胞的表型和功能。细胞刷及宫颈灌洗样本的采集是一种无创操作，必须由妇科医生或经过培训的医师进行。

首先进行宫颈阴道灌洗，用2毫升PBS冲洗子宫颈管内壁，随后从后穹窿处收集灌洗液。将宫颈刮匙的凹端紧贴宫颈并旋转，以采集宫颈开口或宫颈外口的样本。接着，将细胞刷插入子宫颈管内口，旋转360度。

使用轻柔的压力有助于确保样本不被血液污染。将刮片中的细胞刷收集到含有5 mL PBS的离心管中。样本经冰上运输后，需迅速涡旋震荡，以使细胞从细胞刷上充分解离。

用培养基清洗样本后，再通过孔径为100微米的尼龙滤膜进行过滤。这样可以收集样本中的淋巴细胞、单核细胞和上皮细胞。细胞经处理后即可用针对表面蛋白的抗体进行染色，固定后便可上机进行流式细胞术分析。

我们将向您展示如何分析所得数据，以评估宫颈部位存在的CD4和CD8 T细胞群体的表型。大家好，我是Keith Folk博士实验室的一名博士研究生。我们的研究重点是免疫活化与HIV易感性及疾病进展之间的关联。

由于目前大多数 HIV 感染是通过异性性行为传播的，因此我们也希望明确 HIV 向女性生殖道传播过程中相关的保护性因素。然而，从生殖道采集样本对研究参与者而言往往具有较大挑战性，且侵入性较强。使用细胞刷采集宫颈黏膜分泌物（CMCs）或宫颈单个核细胞是一种比其他方法（如组织活检）更快、更简便的采集方式。

在本视频中，我们将向您展示如何分离和制备用于流式细胞术或其他下游应用的宫颈单个核细胞（CMCs）。采集后，细胞刷和刮匙需置于5 mL冷PBS中运输。样品必须在冰上运输，并在采集后两小时内完成处理。

在此阶段，任何被血液痕迹污染的样本均应排除，不再用于后续分析，以将细胞从细胞刷上分离。将试管在高速下涡旋震荡45秒，因为细胞仍会附着在细胞刷和刮匙上，必须手动将其去除。

戴上一副新的手套，使用细胞刷从刮匙上刷下残留的全部材料。将细胞刷丢弃至含漂白液的容器后，用拇指和食指在 Falcon 管上方反复挤压细胞刷，以去除其上残留的所有细胞。丢弃细胞刷后，在准备下一个样品前更换手套，并使用移液管加入 PBS 冲洗管壁，确保收集全部样品。

将一百微米尼龙滤膜安装好。将 PBS 溶液全部体积通过滤膜过滤至一个新的 Falcon 管中，并使用移液器完成过滤操作。向原始试管中加入 5 mL 不含 FBS 的 RPMI 培养基。

使用移液器彻底冲洗管壁，以去除任何附着的黏液或碎屑。然后将培养基通过滤器转移。在将滤器丢弃至漂白剂中之前，用部分过滤后的培养基冲洗滤器底部。

为了沉淀分离的细胞，将样品在1500 r pm条件下离心10分钟，以防止沉淀物脱落。如果细胞将用于流式细胞术，请记得关闭离心机刹车。

配制用于防止非特异性抗体结合的封闭液。在离心步骤中，每份样品使用 100 微升封闭液。封闭液包含 93.2 微升 FACS 洗涤液或 PBS，加上 5 微升 FBS（终浓度为 2%）以及 1.8 微升小鼠 IgG。

离心后，大多数含有活细胞的样品会出现可见的沉淀。在某些情况下，沉淀可能较为明显；而在其他样品中，沉淀可能 barely visible。

沉淀物的大小并不总是与细胞产量相关。小心地倾倒上清液，确保不扰动细胞，然后通过轻柔振荡重悬沉淀。用5 mL PBS洗涤细胞，并在1500 ×g条件下再次离心10分钟。

再次加入含折断部分的 RRP M，倾去上清液，并像之前一样重悬沉淀。此时，细胞已准备好进行冷冻保存或表面染色。在使用荧光抗体染色前，通过将细胞与之前离心步骤中制备的封闭液孵育，以阻断非特异性结合，这一步骤非常有益。细胞沉淀重悬后，向样品中加入 100 µL 封闭液，并充分混匀。

剩余的实验步骤可在96孔板或离心管中进行，具体取决于CMC沉淀物的大小。将封闭液和细胞混合物转移至离心管中。

将样品在 4 摄氏度下孵育 10 分钟。在 10 分钟孵育期间，准备用于区分活细胞和死细胞的活力染料。数据分析时，根据制造商说明配制活力染料，并按需预先进行滴定。

务必在染料混合物使用前用遮光材料覆盖，避免光照。孵育10分钟后，用500 µL含2% FBS的FAX、洗涤液或PBS洗涤细胞，然后在1600 ×g下离心10分钟。离心后，倾去FAX管中的上清液。

通过振荡重悬细胞。随后加入先前配制好的适量活力染料。将细胞在4°C下孵育30分钟，并确保样品用锡箔包裹以避光。

孵育期间，可准备用于标记细胞的荧光抗体主混合液。在将抗体用于CMC之前，务必先在外周血对照样本上进行预滴定和验证。将已滴定的抗体混合，并调整至每样本100 µL的最终体积。

在整个操作过程中，使用 Fax Wash 对抗体进行洗涤，并避免抗体接触光线。30 分钟孵育结束后，再次用 500 微升 Fax Wash 缓冲液洗涤样本，离心，弃上清，并像之前一样重悬细胞。接下来，将细胞与 100 微升在前次孵育步骤中配制的抗体混合液共同孵育。

再次将样品在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，并确保避光。孵育后的 CMCs 现在已准备好最后一次用 500 微升 PBS 洗涤。以 1600 转/分钟离心样品 10 分钟。

倾析后，将沉淀重悬，并在终体积为750微升的1%多聚甲醛溶液中稀释细胞。为了固定细胞，必须将细胞重悬于较大体积的溶液中，以防止堵塞流式细胞仪。即使在此体积下，样品管仍可能显得相当浑浊。

将细胞置于4°C避光保存，直至在流式细胞仪上进行检测。除了细胞刷样本外，我们常规收集2毫升来自宫颈和阴道的PBS灌洗液。该样本以1400转/分钟离心7分钟，以去除灌洗液中的细胞碎片。

剩余的上清液可分装后于-80摄氏度冷冻，用于后续可溶性蛋白浓度的分析。该数据与通过流式细胞术获得的细胞表型数据结合时尤为有用。在运行您的CMC样本之前。

建议制备PBMC对照样本，以帮助调节补偿管的设门，可使用微球或单染细胞来校正光谱重叠。应采集完整的CMC管，以获取全部事件，与PBMC样本进行比较。在FSC面积与高度图中，CMC可能出现更多的双联体，且其淋巴细胞群可能不如PBMC明显。

在获取样本后，将文件导出至 FlowJo 等软件进行分析。此处我们将展示针对CMC来源的CD4阳性与CD8阳性T细胞的典型设门策略的主要组成部分。使用FSC面积与高度散点图对样本中的单细胞进行设门。

在此匹配比较中，可以明显看出与 p BMCs 相比，CMC 样本中双峰细胞的数量增加。接下来，绘制荧光标记物或 FSC 对时间的图可作为质量控制步骤。如果流速的任何变化在数据中引入了伪影，可在该步骤中将其去除。

在上方，您可以看到随时间变化的稳定荧光信号，表明样品质量较高。在下方，您可以看到一个存在多次中断和流速波动的样品，该样品可被排除在进一步分析之外。在 CMC 样品中识别淋巴细胞群体可能具有挑战性。

使用 A-P-B-M-C 控制将有助于步态定位。如您所见，某些样本显示出明显且清晰的细胞群，而其他样本则缺乏淋巴细胞群。总体而言，这些样本应被排除。

尽管我们将重点关注淋巴细胞群体，但也可以通过圈选不表达谱系标记物的细胞来分析单核细胞。可以鉴定表达树突状细胞和单核细胞标记物组合（如 CD16 和 CD11c）的细胞。即使使用新鲜细胞进行 CMC 分析，加入活率标记物或染料也至关重要。

如您所见，CMC 淋巴细胞的大部分是活细胞，但某些样本中含有较高比例的死细胞，必须在分析中将其排除。死细胞可能会非特异性地结合抗体，从而干扰淋巴细胞门内数据的分析。CD3 染色应具有良好的强度。

CD3阳性T细胞的比例低于外周血单个核细胞（PBMC）样本，且变异性更大，因此必须获取全部肝脏单个核细胞（CMC）样本，并尽可能多地收集细胞事件数量。CD4阳性与CD8阳性T细胞亚群的鉴定方法与胸腺单个核细胞（TBMC）样本中的鉴定方法相同。在部分CMC样本中。

CD4与CD8的比值低于外周血中观察到的水平，且部分个体表现出大量的双阴性T细胞群体。在鉴定出CD4阳性与CD8阳性的T细胞群体后，可对多种表型标志物的表达进行定量分析。尽管可在宫颈黏膜单个核细胞（CMCs）中检测到CD161的表达，但在血液中明显的CD161强表达群体在生殖道中则不存在。

类似地，可在宫颈黏膜细胞（CMC）样本中可靠地检测并定量激活标志物（如 CD69 和 HLA-DR）以及 CCR5 和 PD-1 等其他标志物的表达水平。使用细胞刷样本可使我们对黏膜免疫细胞的表型和功能进行表征，尤其在感染性疾病的背景下具有重要意义。这不仅有助于深入理解调控黏膜免疫和生殖免疫的机制，也为开发评估黏膜疫苗有效性的新方法奠定了基础。