一种高效提取人输卵管上皮细胞用于单细胞分析的方法

我们的研究重点是了解并应对卵巢癌的化疗耐药性。我们致力于发现驱动耐药性的机制和细胞亚群，以及可清除这些侵袭性细胞群体的新靶点。

单细胞RNA测序有助于表征异质性卵巢肿瘤中的亚群。我们利用非癌变的输卵管上皮细胞作为卵巢癌分析的正常起源细胞。

高效分离输卵管上皮细胞并获得富集的单细胞悬液，将有助于进一步理解高级别浆液性卵巢癌的疾病发生机制。这种机械与酶消化相结合的技术为提取高活性的富集输卵管上皮单细胞悬液提供了更为高效的方法。

[讲述者] 首先，将新鲜的人类输卵管组织收集到含有解离培养基的15或50毫升离心管中，并将离心管置于冰上。将输卵管转移至含有新鲜解离培养基的无菌培养皿中，并将样本置于体视显微镜下。使用尖头镊子和Vannas-Tubingen剪刀，剥离输卵管周围的脂肪、结缔组织及任何血管组织。然后，用剪刀沿输卵管的冠状面剪开，形成直径为3至5毫米的小圆柱状组织块。剪切过程中，使用尖头镊子固定组织以保持稳定。小心吸除含有组织碎片的培养皿中的解离培养基。用2毫升冰冷的1×PBS洗涤组织碎片两次，并轻轻旋转培养皿。吸除PBS后，在室温下用冰冷的5毫摩尔EDTA孵育组织碎片5分钟。将组织碎片悬浮于冰冷的1%胰蛋白酶Hanks平衡盐溶液中，并在4°C下孵育40分钟。吸除1%胰蛋白酶Hanks平衡盐溶液，再用冰冷的解离培养基洗涤组织碎片两次，以灭活胰蛋白酶。将组织碎片在含有0.4毫克DNase的2毫升解离培养基中，于室温下孵育至少30分钟。在体视显微镜下，仍在DNase培养基中，用镊子夹住一段输卵管组织，使其管腔与培养皿底部平行。用镊子反复按压组织，以从管腔中挤出上皮细胞。确认组织周围释放出一圈细胞晕。将含有细胞的培养基转移至无菌的15毫升离心管中。用解离培养基洗涤培养皿两次，并将洗涤液合并至同一离心管中。弃去剩余的间质组织碎片。为收集细胞，以500g离心5分钟。吸除上清液，将沉淀物重悬于1毫升解离培养基中。取10微升细胞悬液与等体积的台盼蓝混合。用移液器将10微升混合液加入细胞计数板的计数室中，插入细胞计数仪以测定细胞数量。将细胞重悬于含有I型胶原酶和DNase的9毫升解离培养基中。在37°C、200 RPM的摇床中孵育30至45分钟。为收集细胞，以500g离心5分钟。吸除上清液后，将沉淀物重悬于5毫升解离培养基中，以洗去胶原酶。将细胞悬液通过100微米细胞滤网过滤至50毫升离心管中，将滤液以500g离心5分钟。若细胞沉淀呈红色，则配制红细胞裂解缓冲液以裂解红细胞。吸除沉淀中的培养基，加入5毫升稀释的红细胞裂解缓冲液，并将样本置于冰上孵育3分钟。为终止红细胞裂解，向离心管中加入45毫升1×PBS。以500g离心5分钟。收集细胞并重悬于1毫升解离培养基后，取10微升细胞悬液与等体积的台盼蓝混合。用移液器将10微升混合液加入细胞计数板的计数室中，插入细胞计数仪进行检测。流式细胞术分析证实，从输卵管组织中成功分离出活力良好且富集的上皮细胞群体，平均细胞活力为82%。去除CD45阳性免疫细胞后，EpCAM阳性上皮细胞平均占样本总量的80%，而CD10阳性间质细胞污染极少，仅为7.8%。分离的上皮细胞在接种后4至6天内于二维培养中形成贴壁的鹅卵石样细胞簇，证实其上皮特性。免疫化学染色显示，大多数培养细胞表达EpCAM和PAX8，仅有少量波形蛋白阳性细胞。培养物中可见纤毛细胞。