基于细胞谱系引导的质谱蛋白质组学在发育中（青蛙）胚胎中的应用

这种基于细胞谱系的研究方法能够在脊椎动物胚胎内以空间和时间分辨率对重要的发育事件进行蛋白质组学分析，提供通过整体胚胎测量无法获得的信息。该方法可轻松扩展应用于研究胚胎细胞在发育过程中分化时的蛋白质、代谢物和转录本。此技术有助于加深我们对调控正常发育与疾病发生分子机制的理解，包括早期发育过程中组织诱导和细胞命运决定的机制。

使用毛细环将每个胚胎引导至孔中，并轻轻调整其位置，使目标细胞与显微针成合适的角度。参照非洲爪蟾（xenopus laevis）的组织命运图谱，确定所关注谱系的前体细胞。使用两把锋利的镊子轻轻去除包围胚胎的卵黄膜。

使用镊子通过手工解剖从胚胎中分离单个细胞。首先准备含有谱系示踪剂溶液的注射针，将显微注射针安装到由多轴显微操作器控制的微移液管固定器中。

将微量移液器固定器连接至显微注射仪，并通过施加负压使针头充满谱系示踪剂。校准针头，调整针尖大小和注射时间，以注入约一纳升谱系示踪剂溶液（以矿物油中测量为准）。确保所注射液滴体积准确，必要时调整注射仪参数。

用3% fCAL溶液充满显微注射用黏土培养皿，使用转移移液管将约10个胚胎转移至该培养皿中。向目标细胞注射约1纳升荧光葡聚糖或200皮克GFP mRNA。在体视显微镜下观察，确认细胞标记成功。

确保仅对目标细胞进行注射。根据机构规定，弃去含有受损或标记错误细胞的胚胎。将注射后的胚胎转移至含有0.5x Steinberg溶液的培养皿中。

在14至25°C条件下培养，直至达到所需的发育阶段。将3至5个胚胎转移至含有0.2x Steinberg溶液的琼脂培养皿中，用于显微解剖。使用镊子从胚胎中解剖出标记的克隆。

使用0.5至10微升移液器收集解剖后的组织，并将其转移至微量离心管中。用移液器吸除收集到的组织周围的培养基，以减少样品中的盐分，避免对高分辨质谱（HRMS）分析产生干扰。将样品管置于干冰或液氮上，立即冷冻保存分离的细胞。

将样品在负80摄氏度下保存，直至进行质谱分析。对于通过毛细管电泳处理的单细胞样品，通过将样品加热至60摄氏度约15分钟使蛋白质变性。然后将样品在室温下平衡5分钟，并向样品中加入胰蛋白酶以进行消化。

进行NanoLC分析时，将最多五份解剖组织在50微升裂解缓冲液中裂解。通过反复吹打样品以促进裂解过程。处理解剖组织时，将裂解液在4摄氏度下孵育10分钟。

然后在 4 摄氏度下以 4,500 RCF 离心，沉淀细胞碎片和卵黄小板。将上清液转移至洁净的微量离心管中，并加入 10% SDS，使裂解液中 SDS 的终浓度为 1%。对于组织样品，向裂解液中加入 0.5 摩尔的二硫苏糖醇，使其终浓度约为 25 毫摩尔。

然后将裂解液在60摄氏度下孵育30分钟，以化学还原蛋白质中的二硫键。加入0.5摩尔的碘乙酰胺，使裂解液中终浓度约为75毫摩尔，并将混合物在室温下避光孵育15分钟。加入与初始体积相同的0.5摩尔二硫苏糖醇，以淬灭烷基化反应中剩余的反应物。

按照文本方案所述，用丙酮过夜沉淀蛋白质，并用 0.5 摩尔碳酸氢铵重新溶解。加入胰蛋白酶进行样品消化，并将样品管在 37 摄氏度下孵育。为使用毛细管电泳分离肽段，将消化后的蛋白质重新溶解于一至两微升的样品溶剂中。

将混合样品涡旋振荡，并在4°C条件下以10,000 RCF离心两分钟，以沉淀细胞碎片。通过用BGE冲洗CE毛细管来启动CE-ESI仪器。取1微升样品加入样品瓶中，并通过流体动力学进样将1至10纳升样品注入CE分离毛细管中。

将毛细管电泳分离毛细管的进样端插入背景电解质溶液（BGE）中。通过逐步升高毛细管电泳分离电压（从接地电位开始）启动电泳分离。采用20至28千伏的电压，电流低于10微安，可确保仪器在分析过程中具有稳定且可重复的性能。

使用纳米液相色谱（Nano LC）进行分离时，将肽样品重新悬浮于流动相A中。样品的浓度和进样体积取决于所用的液相色谱系统和色谱柱。将样品转移至液相色谱小瓶中。将约200纳克至2微克的肽样品加载至C18分析柱，并按照文本稿件中所述的梯度洗脱程序，以300纳升/分钟的流速分离肽段。

使用相机检查液体在电喷雾发射器中的流动情况，并目视检查装置是否存在可能的泄漏。按照文稿中所述方法获取质谱事件并测序肽段。利用毛细管电泳-电喷雾-高分辨质谱法（CE-ESI-HRMS）检测了从不同胚胎中分离的D11细胞之间的基因翻译差异。

通过液相色谱-高分辨质谱法（LC-HRMS）分析了谱系标记的分离细胞克隆。蛋白质通路分析显示，在脊索中胚层与神经外胚层中，蛋白质翻译和能量代谢相关蛋白表达上调。神经外胚层原肠富含与细胞内蛋白质货物核转运相关的蛋白，可能提示信号传导后的下游事件。

分子功能富集分析显示，翻译起始、RNA结合以及蛋白酶体复合物的结合均出现上调，提示动态蛋白质转换在斯佩曼组织者发育过程中发挥重要作用。为提高实验的可重复性及结果解读的准确性，本方案应仅选用具有典型表型的胚胎。解剖所得组织应转移至样品瓶中，并尽可能减少培养基缓冲液的残留，立即冷冻，以最大限度降低缓冲盐带来的污染。

这种方法使我们能够在活体胚胎中研究已鉴定细胞及细胞谱系中的蛋白质动态变化。我们所获得的关于发育组织中重要蛋白质时空表达的新信息，使我们能够设计有针对性的实验来评估其生物学功能。