利用冷冻电子断层扫描与自动化子断层平均化技术测定HIV包膜糖蛋白的分子结构

已有超过6000万人感染了导致艾滋病的病毒——人类免疫缺陷病毒（HIV）。HIV/AIDS 是一场全球性的公共卫生危机，尽管深入的研究工作已显著延长了感染者的寿命，但真正有效的疫苗至今仍未问世。目前HIV疫苗研究的一个主要方向是病毒的包膜糖蛋白，HIV正是利用这种蛋白进入靶细胞。

在本视频中，我们展示了如何利用一种名为冷冻电子断层扫描的成像技术，获得这种重要蛋白质的结构。从纯化的HIV开始，我们演示了冷冻样品制备的步骤、从这些冷冻样品中采集透射电子显微镜图像的步骤，以及将这些图像转化为可用于HIV艾滋病疫苗设计的结构模型的步骤。本视频展示内容的一个独特之处在于，实验工作将由实验室成员亲自完成，其年龄跨度广泛，包括初中和高中学生、大学及研究生阶段的学生，直至博士后研究员和资深科学家。

制备适用于冷冻电子断层扫描的玻璃化病毒样品，需将病毒的水相悬浮液铺展在由铜网支撑的碳膜小孔上，随后迅速冷冻病毒。该步骤的目的是制备出完整病毒颗粒的冷冻样品，使其保持接近天然状态。首先，将载网放入电晕放电仪中。

该设备通过将载网暴露于离子化气体中对其进行清洁。现在载网已准备就绪，接下来制备含有病毒悬浮液与微小金颗粒的混合物。这些颗粒对于数据的采集与处理至关重要。

接下来，将一滴病毒悬液置于 freshly plasma cleaned 载网上。然后将载网放入机器人装置中，用滤纸吸去多余液体，使液滴形成一层薄膜。随后将样品迅速浸入液态乙烷中，使病毒以超过每秒 100,000 开尔文的速率快速冷冻。

将冷冻后的载网转移至储存盒中，以便运送至显微镜。重复此步骤，直至制备出所需数量的载网。现在病毒样品载网已准备就绪，下一步是将其装入显微镜中。

在成像过程中，此步骤可手动完成，也可借助机器人辅助完成。当手动加载样品载网时，操作人员坐在专用操作台前，在液氮环境下对样品进行操作，随后将样品放入一个便携式氮气冷却腔室中，密封、抽真空，然后连接至显微镜。较新型的显微镜具备更高程度的自动化样品加载能力。

在此Titan Cryos显微镜中，用户将冷冻样品送入显微镜，随后通过机器人自动装载载有样品的载网。在开始成像之前，用户可对每张载网进行检查。针对样品载网上具有感兴趣特征的每个区域，需分别设置显微镜参数。

在此情况下，这些特征是HIV病毒。每当定义一个新的区域时，显微镜的计算机将存储该区域特定的成像参数。当用户定义完所有感兴趣的位点后，计算机会自动重新访问每个位点并采集一组数据。

每个数据集的采集都需要相对于电子束倾斜样品网格，同时确保电子束始终聚焦在网格的同一位置上。在电子显微镜中，数据采集传统上要求用户坐在显微镜前，并与设备进行物理交互。这种显微镜操作方式在奥巴马总统参观英特尔工厂期间的访问中有所展示。

显微镜计算机接口的最新进展使得用户能够通过实验室内外的远程计算机实时监控和调整数据采集。为了可视化包膜和糖蛋白刺突的形态，必须对数百张单独图像的信息进行平均处理，以增强信号。这一计算密集型过程在此通过使用名为 Bio Wolf 的计算机集群来完成。

位于美国国立卫生研究院（NIH），研究人员已开发出强大的方法，能够提取单个体积数据，并利用可在高噪声水平下运行的算法对信息进行平均。这类数据固有的特性使得从天然病毒以及与生物学重要分子形成复合物的病毒中获得的密度图，为HIV的结构生物学提供了丰富的信息数据库。当这些数据与包膜糖蛋白刺突各个亚基的X射线晶体学信息相结合时，密度图便在分子细节层面呈现出生动的结构图像。

这些断层扫描产生的数据可能非常密集且难以解释。可以使用娱乐行业的三维软件，通过添加颜色、纹理和光照来可视化三维模型，从而使其更易于分析。常用的可视化软件包括 Mirror 3D Studio Max 和 Maya。

我们刚刚逐步演示了如何从纯化的 HIV 出发，获得包膜糖蛋白结构的分子模型。利用该方法，我们还确定了包膜糖蛋白与多种能够结合并利用该病毒的分子形成复合物后的结构。

在此，我们展示了包膜糖蛋白与一种名为B12的抗体形成复合物的结构示例。了解为何某些分子能够结合并利用病毒，而其他分子则不能，对于合理设计疫苗至关重要。解析来自HIV或其他病毒（如流感病毒和埃博拉病毒）的包膜糖蛋白的分子结构，是理解病毒进入和利用机制的关键。

正如您所见，冷冻电子断层扫描技术现已成为实现这一目标的强大工具。