通过下一代测序进行靶向DNA甲基化分析
2015年2月24日
亚硫酸氢盐扩增子测序（BSAS）是一种用于定量目标基因组区域中胞嘧啶甲基化水平的方法。该方法在下一代测序之前，结合亚硫酸氢盐转化与目标区域的PCR扩增，从而在单碱基水平上实现DNA甲基化的绝对定量。
本实验的总体目标是从感兴趣的组织或细胞中分离出基因组DNA，并对其中的目标区域进行CpG甲基化的定量分析。该目标首先通过设计亚硫酸氢盐特异性PCR引物来实现，用以扩增经亚硫酸氢盐转化的基因组DNA中的目标区域。第二步，对经亚硫酸氢盐转化的目标区域进行扩增，并利用扩增产物构建下一代测序（NGS）文库。
接下来，对文库进行测序并生成用于分析的FASTQ文件。最后一步中，将测序读段比对至经亚硫酸氢盐转化的参考靶序列，并最终通过亚硫酸盐扩增子测序（BSAS）精确且准确地计算5mC百分比，该方法可用于对任意模式生物中任何感兴趣区域的CpG甲基化进行精确定量。与Sanger测序等现有方法相比，该技术的主要优势在于，BSAS能够以快速、高通量的方式实现准确且精确的CpG甲基化定量，从而可对大量样本中的多个区域同时进行检测。
在确定目标并设计引物后，构建用于单一条目扩增优化的反应体系，然后使用热封膜密封PCR板，通过琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物。接下来，向合适的加样孔中加入30微升PCR反应产物或DNA分子量标记物，然后在200伏电压下电泳约45分钟。当第一条染料迁移至凝胶末端时，停止电泳反应，随后将凝胶完全浸入含有5微克/毫升新鲜配制的AUM溴化物溶液中染色。
五分钟后，使用激发波长为482纳米的紫外透射仪对凝胶成像。利用DNA分子量标记确定PCR扩增子的大小，以判断反应的特异性。观察除预期扩增片段大小以外的多条条带，以确定检测到的文库峰的平均大小及摩尔浓度的估算值。
接下来，按照制造商的说明，使用高灵敏度DNA检测试剂盒在毛细管电泳DNA片段分析芯片上运行文库。通过QPCR对文库进行定量时，使用针对文库中接头序列设计的引物，并结合已知浓度的标准品，在实时定量PCR仪上采用绝对定量模式，按照制造商提供的操作说明进行。
然后根据文库的大小以及QPCR的摩尔定量结果，计算文库的摩尔浓度。测序完成后，将压缩的fastQ文件导入相应的测序分析流程，选择“导入”，然后选择用于生成测序读段的测序方法，以保留读段修剪应用所需的Q值。导入相应的压缩fastQ读段文件，然后在常规选项中，取消勾选“丢弃质量分数”。
选择导入读段的位置，然后单击完成。接着在 NGS 核心工具下选择修剪序列。选中需要修剪的读段，仅保留质量值大于或等于 Q 30 的读段。
然后根据质量得分选择修剪，并将阈值设为 0.001。进一步筛选仅包含少于或等于一个模糊碱基的序列。选择修剪模糊碱基，并将最大模糊碱基数设为 1。
然后选择一个位置以保存修剪后的读段，点击“完成”以将修剪后的读段比对至体外经亚硫酸氢盐转化的基因参考序列。在NGS核心工具中，选择“比对读段”。在参考序列选项中，选择要进行比对的修剪后读段，然后点击“下一步”。
然后在参考序列屏蔽设置中，选择已转换的参考序列，并选择不进行屏蔽。单击“下一步”，随后为错配、插入和缺失分配得分为3。为比对读段长度占参考序列的最小比例分配得分为1，并在非特异性匹配处理中，为比对读段与参考序列之间的最小一致性比例分配得分为0.9，选择“忽略”，然后在输出选项中单击“下一步”。
接下来，选择创建独立的读段比对。然后在结果处理下，点击保存。选择一个位置来保存读段比对结果，然后点击完成，以对已比对的读段运行变异检测。
在重测序分析中，选择低频变异检测，并选择要分析的读段比对结果。单击“下一步”，然后在低频变异参数下输入 0.01%，再单击“下一步”。在通用过滤器中，将最小覆盖深度设置为 1000，以确保序列的测序深度大于或等于 1000 ×。
最后，单击“下一步”，然后在输出选项中选择“创建注释表格”，并选择保存变异位点表格文件的位置，单击“完成”，并从变异位点表格文件中获取目标区域注释后的 CPG 位点上的变异频率，用于计算参考胞嘧啶在 CG 背景下的胞嘧啶甲基化频率。通过亚硫酸盐扩增子测序读段比对到转化后的参考序列，其比对结果将如图所示。CPG 二核苷酸可被清晰识别，通过观察 CPG 位点处的碱基识别情况即可估计其甲基化状态。在比对到的读段中，0% 甲基化将表现为在 CPG 位点处比对到胸腺嘧啶（T）的读段。
100%甲基化对照将产生包含在CpG位点处映射到胞嘧啶的测序读段。在本实验中，从一只小鼠的小脑和视网膜中共同分离了RNA和DNA。随后通过qPCR检测视网膜组织中选择性表达的视蛋白表达水平，结果符合预期。
通过亚硫酸盐扩增测序对Opsin启动子区域的CpG甲基化水平进行定量后，仅在视网膜中检测到opsin RNA。然而，小脑中该启动子区域的累积甲基化水平超过80%，而视网膜中的累积甲基化水平则低于15%。Bis-SAS甲基化定量技术具有位点特异性甲基化定量的优势，可在任何给定基因组区域内以单个CpG为单位比较甲基化水平。
事实上，在本实验中，与视网膜样本相比，小脑样本中视蛋白启动子区域的CpG甲基化水平显著更高。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对从组织或细胞中分离的基因组DNA中特定目标区域的CpG甲基化水平进行定量分析。
概述
亚硫酸氢盐扩增子测序（BSAS）是一种用于定量特定基因组区域中胞嘧啶甲基化水平的技术。该方法结合了亚硫酸氢盐转化、PCR 扩增和高通量测序，以实现对甲基化程度的精确定量。
关键研究要素
科学领域
- 基因组学
- 分子生物学
- 表观遗传学
背景
- BSAS可用于分析DNA甲基化模式。
- 该方法在研究基因调控和表达方面尤为有用。
- 该方法可对多个样本进行高通量分析。
- 与Sanger测序等传统方法相比，该方法具有优势。
研究目的
- 准确定量目标基因组区域中的 CPG 甲基化水平。
- 加深对不同生物学背景下表观遗传调控机制的理解。
- 促进对不同模式生物中甲基化分析的研究。
使用的方法
- 设计用于目标扩增的特异性PCR引物。
- 扩增经亚硫酸氢盐转化的基因组DNA。
- 从PCR扩增子构建NGS文库。
- 对生成的FASTQ文件进行测序与分析。
主要结果
- 成功量化了不同组织中 CPG 的甲基化水平。
- 揭示了小脑与视网膜之间甲基化模式的差异。
- 基于甲基化状态，提供了关于视蛋白表达调控的新见解。
- 验证了 BSAS 在甲基化分析中的准确性和精确性。
结论
- BSAS 是一种用于定量 DNA 甲基化的可靠方法。
- 该技术增强了研究表观遗传修饰的能力。
- 它在多个研究领域具有应用潜力。
常见问题
行业应用价值
通过亚硫酸氢盐扩增子测序（BSAS）进行靶向DNA甲基化分析，满足了早期发现阶段对高通量、定量表观基因组分析的需求。该方法可精确检测与疾病相关的基因组区域中的表观遗传调控，支持靶点验证和机制层面的风险评估。该技术提供碱基特异性的甲基化定量结果，有助于在临床前研究中开展假设验证和项目筛选。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够在目标基因启动子或CpG岛中对表观遗传机制进行假设验证。
- 科学价值：提供具有碱基特异性的胞嘧啶甲基化绝对定量，用于功能靶点的验证。
- 操作价值：支持每轮运行最多96个样本和10 kb靶向区域的快速分析。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成适用于检测标准化和可重复性评估的定量甲基化数据。
- 操作价值：从扩增子制备适用于可扩展、多重化表观遗传筛查的高通量测序文库。
- 操作价值：通过靶向验证，促进对全基因组甲基化研究中鉴定出的区域进行确认。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过比较不同组织或疾病模型中的甲基化模式，实现与疾病相关的系统分析。
- 科学价值：通过位点特异性甲基化定量，支持转化生物标志物的比对。
- 操作价值：在先导化合物识别之前，对表观遗传机制进行去风险化评估，提供预测性信心。
流程与工作流整合
BSAS 适用于从靶点假设验证到先导化合物鉴定的整个发现过程，能够在关键决策点实现表观遗传学数据的整合。
- Discovery Biology：支持在靶点验证工作流程中探究表观遗传调控。
- Screening：提供定量、高通量的甲基化检测结果，用于化合物或条件间的比较。
- Analytics：生成CpG位点的变异频率数据，以精确计算甲基化水平。
- Translational Research：通过组织特异性的甲基化谱分析，将发现阶段的表观遗传学研究与临床前研究的连续性相连接。
- Enterprise Reuse：建立可重复使用的靶向表观遗传分析能力，适用于多个项目和模型系统。
运营与企业影响
- 科学价值：提高表观遗传机制验证的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：在不同样本集中实现甲基化定量的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过表观遗传学去风险化和提高靶点选择中的资本效率，优化决策流程中的“推进/终止”判断。
- 项目组合影响：基于对疾病相关靶点的表观遗传学验证，进行风险校正后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备亚硫酸氢盐转化、PCR 引物设计和高通量测序文库制备方面的专业知识。
- 依赖于台式下一代测序仪和毛细管电泳设备，用于文库的定量分析。
- 需要在不同团队间对生物信息学分析流程（包括序列修剪、比对和变异检测）进行标准化。
- 需根据不同的DNA来源和目标基因组区域进行方法优化与调整。
- 受限于需要预先了解目标区域信息，以设计特异性引物。
