肺部环境中免疫细胞及促炎介质的表征

本方案可用于研究缺血性脑卒中后肺部环境的变化。该方法可通过流式细胞术分析，在同一只小鼠体内鉴定13种肺部免疫细胞类型以及13种不同的细胞因子和趋化因子。该方法已用于评估缺血性脑卒中后肺部环境的改变。

然而，该方法也可用于研究过敏反应或感染过程中的变化。进行全身经心灌流时，需确认麻醉小鼠对足底反射无反应，然后将小鼠固定于手术平台上。用70%乙醇润湿毛发，以减少毛发散入体腔，沿腹中线做垂直皮肤切口，暴露完整的腹膜，一旦暴露至胸腔即停止切口。

使用精细解剖剪在腹膜上做正中切口，切至胸腔前停止，用镊子夹住胸骨远端。用剪刀剪开膈肌，注意不要损伤心脏、肺或血管。当可见下方组织时，切开肋骨笼，并固定肋骨两侧，使心脏和肺完全暴露。

在靠近主动脉弓的右心房处小心地做一个小切口，作为灌注的流出道，然后迅速而轻柔地将一根25号针头插入左心室的远端上表面。针头就位后，轻柔地向心脏内灌注10毫升冷PBS。组织应开始清除血液。

当全部体积的灌注液输送完毕后，继续灌注第二份10毫升的冷PBS，直至肝脏呈现浅棕色，肺部颜色从粉红色变为 predominantly 白色。使用镊子和精细解剖剪，仔细去除所有周围组织，然后分离肺叶，并将其放入含有1至2毫升冰冷肺细胞培养基的培养皿中，置于冰上。为进行多重微球阵列分析而准备肺组织时，向一个含有三颗无菌2.3毫米氧化锆/二氧化硅珠的2毫升离心管中加入200微升冷匀浆缓冲液，并称量目标肺叶的重量。

取50至100毫克肺组织转移至预冷的含珠子和匀浆缓冲液的离心管中，使用珠子匀浆仪在4,000转/分钟条件下匀浆至少2分钟。待组织完全匀浆后，离心离心管以沉淀组织碎片，并将上清液转移至预冷的1.5毫升离心管中，置于冰上。进行肺组织解离时，小心倾去剩余肺叶中的肺细胞培养基，并将25号针头插入组织中。

向每个肺叶注入200至250微升解离缓冲液，使肺组织膨胀，每个肺叶重复注射两到三次。室温孵育两分钟后，使用精细解剖剪将肺组织剪碎成小块，并将组织悬液转移至15毫升离心管中。向样品中加入6毫升额外的解离缓冲液，剧烈涡旋震荡1分钟。

接下来，将组织块在37摄氏度下孵育45分钟，每隔7至8分钟涡旋振荡一次。孵育结束后，剧烈涡旋振荡样品1分钟，然后将样品通过100微米细胞筛，以去除任何残留的不需要的结缔组织和间质组织。通过离心收集组织，并用5毫升冷肺培养基重悬沉淀。

再次离心样品，并用1毫升冷肺组织培养基轻轻涡旋重悬沉淀。然后，通过100微米细胞筛过滤细胞后再进行计数。为了评估分离的肺组织中的免疫细胞群体，将1至2 × 10⁶个细胞接种至96孔圆底培养板的相应孔中，每孔加入适量的抗体组合，并通过离心将细胞沉淀至孔板底部。

向每个孔中加入25微升适当的抗体混合物（溶于冷FACS缓冲液），并用移液器轻轻吹打混匀。20分钟后，将每孔细胞重悬于100微升冷FACS缓冲液中，并将样品转移至各自含有150微升额外FACS缓冲液的5毫升聚苯乙烯圆底管中。随后，立即根据标准流式细胞术分析方案在流式细胞仪上分析样品。

在此代表性分析中，使用三组包含五至七种抗体组合的方法，在肺组织中鉴定了13种不同的免疫细胞群体。通过活死细胞染料排除死细胞，并利用表格中所列的抗体和标记物区分不同类型的免疫细胞。在第一组中鉴定了肺泡和间质巨噬细胞、CD103阳性树突状细胞和CD11B阳性树突状细胞以及嗜酸性粒细胞。

在第二组中鉴定出促炎性单核细胞和中性粒细胞，在第三组中鉴定出CD4阳性与CD8阳性T细胞、B细胞、浆细胞样树突状细胞、NK细胞以及NKT细胞。使用本方案分离的细胞群与使用商用组织解离仪分离的细胞群相比，活细胞总数占CD45阳性细胞的百分比以及获得的CD45阳性细胞总数均相似。此外，两种方案中CD45阳性细胞的死亡率均低于10%，表明本方案无需自动组织解离仪即可实现高得率、高质量的细胞回收。

此外，使用市售的多重检测法结合流式细胞术分析，可确定每毫克组织样本中趋化因子的浓度。单细胞分离过程中所用的胶原酶D浓度、孵育时间及温度，对免疫细胞的回收率具有关键影响。