通过显微解剖法从发育中的小脑分离不同细胞群体

本实验的总体目标是从发育中的小脑中分离出特定的细胞群体。首先获取携带荧光蛋白的新生小鼠的小脑组织，以完成组织的采集；实验的第二步是使用振动切片机获得活体组织切片。

第三步是在荧光解剖显微镜下显微解剖小脑的外颗粒层。最后的步骤是将组织解离为单细胞悬液，并通过荧光激活细胞分选法收集细胞。最终结果表明，可从小脑中分离出特定的细胞群体。

与现有方法（如激光捕获显微切割）相比，该技术的主要优势在于细胞保持活性，可进行培养，适用于进一步实验。对于本实验步骤，需使用高压灭菌器对手术器械进行灭菌处理。准备新鲜或重新加热的3%低熔点琼脂糖，置于37摄氏度水浴中备用。

配制木瓜蛋白酶为基础的细胞解离所需溶液。新鲜配制NBB 27培养基，过滤除菌后置于培养箱中保存。

配制传真缓冲液并准备多聚赖氨酸盖玻片。首先，用每毫升无菌水中含100微克多聚赖氨酸的溶液包被经高压灭菌的盖玻片。然后在37摄氏度孵育盖玻片2小时，或在室温下过夜孵育。

随后，使用盖玻片前，先用蒸馏水清洗，再用 NBB 27 培养基冲洗。彻底干燥，此过程至少需要一小时才能开始后续操作。

首先准备解剖区域。用70%乙醇擦拭清洁，然后铺上吸水垫。

第二步，从灭菌袋中取出器械并摆放至便于使用的位置。第三步，将含有1% pen strip的冰上预冷的无菌DPBS加入培养皿中，并置于冰上。解剖出一只表达荧光标记物的P4幼鼠的大脑。

然后将其转移至预先准备好的DPBS培养皿中。使用镊子小心地将小脑与脑的其余部分分离。这些小脑表达math one、GFP以及nestin CFP标记物，其中外颗粒层表达GFP，分子层对CFP呈阳性。

接下来，用琼脂溶液填充一个2立方厘米的包埋模具。确保溶液温度不超过37摄氏度。用带孔的勺子取出小脑，并用纸巾轻轻蘸干。

然后使用镊子将其放入模具中。用针将小脑调整为垂直方向。当模具中装入约四个样本时。

将模具置于冰上，使其迅速凝固。使用剃刀刀片修整组织块，以减少切片时间。然后将组织块粘附到载板上，调整方向使小脑垂直。

将装有冰冻 DPBS（含 1% pent strap）的填充托盘置于冰上，以保持低温。使用振动切片机对组织块进行切片，切取并收集 600 微米的切片。

使用带孔的勺子将它们从冰盘中取出，并转移至置于冰上的含 A-D-P-B-S 的培养皿中。在荧光解剖显微镜下，尽快检查切片。

小心地将外颗粒层（EGL）从其余的小脑切片部分分离。使用精细镊子在CFP阳性的分子层与GFP阳性的EGL之间进行解剖。在显微解剖过程中务必谨慎，避免邻近区域的污染。

将GFP阳性的外颗粒层组织转移至一个新的盛有DPBS并置于冰上的培养皿中。避免带入任何分子层组织，以免污染表达巢蛋白的伯格曼胶质细胞。接着，去除围绕分离的外颗粒层组织的软脑膜。

现在可以使用基于paan的方案解离EGL，以获得单细胞悬液。完成后，将细胞重悬于fax缓冲液中。随后使用fax收集CFP细胞。

使用高速流式细胞仪和CFP滤光片进行分选，并将细胞收集到预冷的fax缓冲液中。每只P4小脑可获得约100,000个NPS。随后将合并的细胞在300 G下离心5分钟。

立即使用细胞进行培养复苏。将细胞悬浮于预热的NBB 27培养基中，然后接种到聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上。

从小脑P4 Math1 GFP嵌合CFP小鼠中制备了小脑切片。小脑外颗粒层（EGL）主要包含表达GFP的颗粒神经元前体细胞（GMPs），可轻松与富含表达CFP的胶质细胞的分子层分离。流式细胞分析显示，EGL中超过85%的细胞为典型的颗粒神经元前体细胞（GNPs）。通过显微解剖从EGL深层分离出神经上皮前体细胞（NEPs），随后进行流式分析。

这些细胞在培养四天后约占颗粒层外层（EGL）细胞的5%。分离得到的NPS可分化为表达β微管蛋白的神经元，这是谱系受限的神经前体细胞的特征。

进行此操作时，重要的是要记住快速操作，并尽可能将组织置于冰上。