基于荧光的引物延伸技术用于确定转录起始点及RNase的切割位点 体内

本实验的总体目标是利用荧光引物延伸反应，在体内鉴定细菌中的转录起始位点和RNA切割位点。首先培养大肠杆菌（e coli）或沙门氏菌（S aria）等细菌，并分离其中的RNA分子。随后，使用特异性荧光引物和逆转录酶对RNA进行逆转录，从而获得cDNA片段。

然后从细菌细胞中分离DNA或质粒，并使用测序试剂盒以DNA为模板生成荧光标记的Sanger测序梯度片段。最后，通过自动凝胶测序仪在聚丙烯酰胺凝胶上对cDNA片段和测序梯度片段进行分离并同时检测，随后将二者进行比对。最终，利用荧光引物延伸技术，以单碱基分辨率定位RNA分子的5'端。

与基于放射性或放射活性的引物延伸等其他方法相比，该技术的主要优势在于能够在电泳过程中同步进行检测，从而快速鉴定RNA分子的5′末端。其灵敏度与基于放射活性的引物延伸法相似，但无需实验人员接受放射性辐射安全培训，便于实验室人员使用。我们已成功应用这种荧光引物延伸技术，对毒素-抗毒素系统中的RNA组分进行了研究。

演示该实验操作的葡萄球菌相关步骤将由我实验室的研究生 Christopher Schuster 完成。在制备出高产量的 RNA 并根据文本方案设计引物后，首先将 PCR 仪预热至 95 摄氏度，随后进行引物延伸反应。对于每个 RNA 样本，将以下化合物在 PCR 管中混合，并在 95 摄氏度下变性 1 分钟。

然后将试管置于冰上孵育5分钟，使引物与RNA杂交。接着，将PCR仪温度设为47摄氏度。随后按如下说明配制反转录反应主混合液。

向每个杂交的RNA样本中加入4 µL逆转录主混合液，在47 °C条件下孵育1小时。为终止反应，将样本在95 °C加热2分钟。然后加入6 µL甲酰胺上样染料，避光保存于-20 °C，可保存过夜至两周。

根据文本方案，在制备基因组DNA或质粒后，通过混合约12微升的10至15微克基因组DNA或100至500纳克质粒DNA、1微升荧光标记引物以及1微升DMSO移液器，配制Sanger测序反应体系。将每种测序混合液各取1微升加入预先标记的独立PCR管中。然后向每根试管中加入3微升DNA-DMSO引物混合液。

将PCR仪设置为以下程序，并在将样品放入仪器后运行。运行结束后，向样品中加入6微升上样染料，然后置于冰上。如果立即使用或在-20摄氏度长期保存，请使用洁净无尘的25厘米培养板，在后侧玻璃板上放置0.25毫米间隔器，并将带缺口的玻璃板从上方放下，使玻璃板的缺口端和导轨入口导向器均朝上。

将凝胶支架固定在玻璃板的两侧，并轻轻拧紧旋钮以制备凝胶。将此处列出的化合物加入一个带有搅拌子的烧杯中，置于磁力搅拌器上混合。在加入过硫酸铵（PS）并混匀后，立即使用50毫升注射器吸取丙烯酰胺溶液，并在针头处安装0.45纳米滤膜。

将夹紧的玻璃板以10至20度角放置，一边持续移动移液枪头从一侧到另一侧，一边缓慢将凝胶溶液注入玻璃板之间。当凝胶溶液到达玻璃板底端时，停止加入。使用除泡钩去除可能形成的气泡。

然后将凝胶梳孔间隔器插入带缺口一端的玻璃板之间，浸入凝胶溶液中，并通过轻轻拧紧制胶板上方的轨道螺丝固定间隔器，静置 1 至 2 小时使凝胶凝固。在移除制胶板和梳孔间隔器之前，使用去离子蒸馏水清洗梳孔，去除盐分和凝胶残留物，以便后续电泳。将缓冲槽支架滑入前侧玻璃板的凝胶轨道中，并拧紧旋钮固定。

将凝胶放置于自动凝胶成像仪的下层凝胶槽中，紧贴加热板，并通过滑动导轨定位销插入仪器支架进行固定。使用一份XTBE缓冲液填充上层和下层凝胶缓冲液室。然后关闭下层缓冲液室，并使用电源线将上层缓冲液室连接至电源。

如果胶孔中存在盐分，需使用缓冲液反复吹打孔洞以清洗。然后使用上层缓冲液盖子封闭上层缓冲液槽室。在打开成像仪和计算机，并根据文本方案启动基础图像红外数据采集软件后，使用此处列出的设置来配置扫描仪控制参数。

接下来，通过选择电压并按回车键，对空胶预电泳20分钟。在此期间，使用PCR仪将测序梯度样品和引物延伸产物在90摄氏度加热两分钟。在冰上冷却前，停止电泳，打开自动凝胶测序仪，并取下上层缓冲液槽的盖子。然后将鲨齿梳插入玻璃板之间，并使鲨齿朝向玻璃板。

用移液器将一到两微升的引物延伸产物或测序梯度反应液轻轻刺入每个胶孔中。对于任何空的胶孔，使用上样染料填充，以防止电泳行为不一致，然后关闭缓冲液槽和测序胶仪的门。

然后通过选择电压启动电泳，打开激光选择扫描状态，并按回车键。当目标区域通过激光后，停止电泳，如图所示。引物延伸反应可用于确定目的转录本的转录起始位点（TSP），并有助于推断启动子区域。

在此示例中，MPE mRNA 的转录起始位点（TSP）被确定为 G，与之前发表的数据一致。通过引物延伸法鉴定 mRNA 切割产物，推断出 -35 和 -10 启动子元件分别为 T-T-G-T-A-A 和 T-A-G-A-C-T，这些序列与各自的共识序列仅相差两个碱基。此处显示的是 RNA Ybi SEC 二在切割靠近起始密码子（START codon）时的 RNA 定点定位结果；当该 RNA 不存在或无活性时，由于 RNA 的活性缺失，在起始密码子附近不会形成引物延伸产物。

然而，在该图中起始涂层下游不远处出现了两条强条带，表明该引物延伸实验失败，原因是逆转录反应中RNA过量，从而阻碍了对单个条带的识别。这说明必须根据目的RNA的丰度调整模板RNA的总量。在观看本视频后，您应能够充分理解如何利用荧光引物和自动凝胶测序仪，通过一定练习，在体内解析转录起始位点和RNA切割位点。

该方法操作快速简便。祝您的实验顺利。