基于连续荧光的核酸内切酶偶联DNA甲基化检测法筛选DNA甲基转移酶抑制剂

像我们所采用的这种稳健的酶标仪检测方法，对于初步筛选潜在的甲基转移酶抑制剂非常有用。这种与内切酶偶联的连续检测方法具有实时收集数据的优势。首先，在冰上的微量离心管中，分别配制含有20微摩尔和50微摩尔化合物的反应体系，每种体系准备600微升。

为此，向每个试管中加入重蒸水和5倍浓度的甲基化缓冲液，使甲基化缓冲液的终浓度为1倍浓度。接着，向每个样品中加入3.15 µL浓度为20 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）。然后，向每个样品中加入2 µL浓度为3.15 µmol/L的发夹DNA底物以及1.33 µL浓度为4.75 µmol/L的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。

向适当的样品中加入抑制剂，使其终浓度达到21微摩尔或52.5微摩尔，并向对照样品中加入等量的二甲基亚砜（DMSO），然后在3,000转/分钟条件下涡旋混匀3秒。随后，将样品在台式小型离心机中以1,200 × g离心数秒，确保溶液完全沉降至管底。将每种检测溶液各95微升分装至黑色半区96孔板中的连续六个孔中。

按照之前所述方法，在微量离心管中配制 75 微升 Gla I 或 DNMT1 加 Gla I 酶溶液，使缓冲液的终浓度为 1 倍。接着，向每种溶液中加入 1.2 微升浓度为每微升 10 单位的 Gla I，使 Gla I 的终浓度达到每微升 0.16 单位。向 DNMT1 加 Gla I 溶液中加入 0.6 微升浓度为 5 微摩尔的缺乏 RFTS 结构域的 DNMT1，使其终浓度为 40 纳摩尔。

轻轻混匀后，在台式小型离心机中以1,200 ×g离心数秒，确保溶液完全沉降至管底。随后，将每种酶溶液各12 µL分装至96孔圆底板的六个孔中。进行DNA样品的甲基化检测时，提前将酶标仪预热至37 °C。

然后，将含有检测溶液的黑色酶标板放入酶标仪中。以425 CPM的转速振板后，用485纳米的激发波长和528纳米的发射波长测定荧光值。随后，将酶标板在37摄氏度下孵育5分钟。

从酶标仪中取出检测板，向每孔加入5 µL酶溶液，然后通过上下吹打混合溶液。将检测板插入酶标仪，在30分钟内每53秒记录一次荧光值，记录前需振荡检测板。获取每种条件下三份重复的Gla I对照检测的平均荧光值，并从含有RFTS缺失型DNMT1的三份重复检测曲线中减去含Gla I的对照反应孔的平均荧光值。

然后，计算校正后重复实验数据的平均值及平均值的标准误差。绘制校正后的平均反应曲线，并对初始线性部分进行直线拟合，以确定初始反应速度。通过将化合物存在下的反应速度除以含DMSO的对照反应中的速度，再乘以100，计算出相对活性百分比。

非连续性内切酶偶联实验的结果显示，完全甲基化的产物DNA可免于被切割，证实缺失RFTS结构域的DNMT1具有活性，并能够甲基化半甲基化的底物DNA。在基于荧光的实验中，在不添加Gla I的情况下，单独加入DNMT1或缓冲液均未影响背景荧光信号。随后向所有反应体系中加入Gla I后，仅在含有DNMT1的反应中检测到荧光信号的产生。

在三个实验中同时加入缺失RFTS的DNMT1和Gla I，均产生了强烈的荧光信号。单独加入Gla I则未产生荧光。为筛选潜在抑制剂，检测了在二甲基亚砜（DMSO）、化合物一、化合物二或化合物三分别处于20和50微摩尔浓度下，缺失RFTS的DNMT1的DNA甲基化活性。

在此偶联检测中能够降低荧光生成的化合物必须经过进一步验证。确保这些化合物未抑制偶联酶的活性是接下来的重要步骤。