嗅觉系统作为研究体内轴突生长模式与形态的模型 In Vivo

本实验的总体目标是对嗅觉感觉神经元进行活体标记，以观察其轴突的形态与发育过程。首先将荧光素四号偶联葡聚糖注入单个嗅觉感觉神经元内，实现这一目标。第二步是等待24小时，使染料扩散至感觉神经元的轴突突起中。

接下来，将蝌蚪麻醉，并使用双光子显微镜获取其嗅球的三维图像序列。最后一步是在指定的时间间隔后，对同一动物中标记的神经元进行重复观察。最终，通过细胞形态的重建，可实现对轴突形态变化的可视化分析。

该方法有助于解答神经科学领域中的关键问题，例如轴突如何向大脑前部的目标区域生长，以及突触是如何形成的。实验前，应确保电穿孔装置配备有工作距离较大的体视显微镜，并具备用于染料的荧光照明装置和相应的滤光片组。

用于电穿孔时，可使用专用的单细胞电穿孔仪，或连接示波器的通用方波脉冲发生器。将电穿孔输出端连接至移液管 holder 和浴电极。确保移液管 holder 和浴电极均含有涂覆薄层氯化银的银丝。

接下来，将移液器支架安装到显微操作器上，以实现精确定位。然后，使用含内丝的硼硅酸盐玻璃毛细管制备用于电穿孔的微移液管。设置微移液管拉制仪的参数，以制备具有较长柄部和较小尖端开口、且移液管电阻较高的微移液管，适用于单细胞电穿孔。

然后使用专用的单细胞电穿孔仪直接测量移液管电阻。在此步骤中，将荧光素四偶联葡聚糖以3毫摩尔浓度溶解于蛙林格液中。将该储备溶液分装成小份，取其中一份冷冻保存以备后续使用。

接下来，用一到五微升的葡聚糖溶液回填微量移液管。轻轻弹击微量移液管，以去除移液管尖端残留的气泡。然后将微量移液管安装到移液管固定架中。

确保移液管内的银丝与染料溶液接触。现在，将一小块组织放入培养皿中，并用含有0.02%三卡因（trica）的少量水覆盖。接下来，用含有0.02%三卡因（trica）的水对变态前的蝌蚪进行麻醉。

通过触碰确认麻醉效果，确保蝌蚪无反应。然后小心地将蝌蚪转移至覆盖有组织的培养皿中。确保电极与湿润的组织接触，并使用显微操作器将微移液管尖端置于蝌蚪嗅觉器官附近。

随后，穿透覆盖嗅觉器官的皮肤。使用移液器尖端小心地将其推进至主嗅上皮或MRO鼻上皮中央位置的感觉神经元层。接着施加正向方波电压脉冲，通过单个电压极或多个脉冲序列，将染料导入感觉神经元中。

然后使用荧光体视显微镜观察染料成功排出及电穿孔的效果。成功的电穿孔后，染料会迅速扩散至细胞体和树突中。完成对蝌蚪第二个嗅觉器官的重复操作后，将蝌蚪转移至盛有新鲜水的烧杯中恢复，并让电穿孔导入的染料扩散至感觉神经元和嗅球。

电穿孔后至少 24 小时，将蝌蚪置于含有 0.02% trica 的水中进行麻醉。随后，小心地将蝌蚪转移至成像室。从一段 param 条上裁下一小块矩形区域。

然后用固定剂覆盖蝌蚪，使前部尾头通过切口窗露出。用针将固定剂固定在培养皿上，注意不要损伤蝌蚪，并确保蝌蚪浸没在含有0.02% Trica的足够水中。随后将成像室安装在直立式多光子显微镜或共聚焦显微镜的载物台上。

获取嗅球的三维图像序列，并确保成像过程不超过10至15分钟。之后，将蝌蚪放回单独水箱中的正常水环境中，并避免其暴露于光照下。在此图像中，四束连接不同荧光染料的DNA链通过电穿孔技术导入嗅觉器官的四个不同位置：外侧以绿色表示，中间区域以黄色表示，内侧以红色表示，犁鼻器器官以橙色表示。

这可以实现对副嗅球以及主嗅球三个主要投射区域的可视化。该图像展示了单个嗅觉感觉神经元不同轴突生长模式的三维重建结果，叠加于嗅球结构之上；此处为单个嗅觉感觉神经元轴突投射进入嗅球，并在球状小球内形成簇状分支的示例。如 Opus Levu 中所示，这些轴突在连接一个、两个或多个小球前会规律性地分叉。

这是一个通过活体延时成像反复观察的单个嗅觉感觉神经元的代表性示例，显示了其轴突形态的持续变化。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过电穿孔技术标记嗅觉感觉神经元，以及如何利用活体延时成像技术监测其发育过程。