用于可视化嗅觉感觉轴突分子身份编码的嗅球四重免疫染色

该免疫组织化学染色方法的总体目标是可视化嗅觉感觉神经元轴突末端中轴突分选分子的共表达情况。该方法有助于表征嗅觉发育领域中的关键过程，例如轴突导向、突触形成以及嗅觉感觉神经元的再生。该技术的主要优势在于，它允许科研人员在不受到切片间变异影响的情况下，对嗅球中轴突分选分子的表达模式进行比较与分析。

该方法的可视化演示至关重要，因为包埋步骤难以掌握，嗅觉组织样本在模具中的位置和角度很难用文字描述清楚。取经心脏灌注4%多聚甲醛固定的1至2周龄小鼠头部开始操作。将剪刀刀片插入上下牙齿之间的空隙，水平剪切以去除下颌骨。

然后用镊子和剪刀修剪掉多余的组织，保留嗅觉组织，包括嗅球和嗅觉上皮。将嗅觉组织浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中以去除鼻腔内的空气，接着进行垂直切割，去除脑组织的后部，将嗅觉组织切面朝下放置于包埋模具底部。向模具中加入最佳切割温度化合物（OCT），然后浸入液氮中。

组织与OCT完全冷冻后，在-20摄氏度的冷冻切片机中平衡组织一小时。随后使用冷冻切片机对嗅球进行连续冠状切片，并将切片贴附于MAS涂层载玻片上。贴片后立即用吹风机干燥载玻片。

开始免疫染色，将干燥的载玻片在室温下用 PBS 洗涤五分钟。在室温下用 5% 封闭液孵育载玻片一小时，以封闭非特异性结合位点。然后向每张载玻片加入 400 微升用 1% 封闭液稀释的一抗混合液。

将切片在室温下孵育过夜。次日，弃去一抗溶液，用PBST在室温下洗涤切片，每次5分钟，共洗涤三次。然后向每张切片加入400 µL含有二抗的混合液和PBS。

避光，室温孵育一小时。孵育结束后，弃去溶液，再用 PBS 在室温下洗涤载玻片三次，每次五分钟。最后，向每张载玻片滴加两滴封片剂，盖上盖玻片，去除气泡，完成封片。

使用荧光显微镜并针对每种荧光染料选择适当的滤光片获取荧光图像。调整曝光时间，以获得无饱和的荧光信号图像。通过GLUT2的免疫荧光信号界定肾小球结构。

使用 Image J 测量嗅小球内轴突分选分子的染色强度。该图像显示了两周龄小鼠嗅球的矢状切面，经免疫染色标记 VGLUT2、Kirrel2（红色）、Semaphorin 7A（绿色）和 OLPC（蓝色）。合并图像表明，参与嗅小球分离的轴突分选分子以位置无关的镶嵌模式表达。

每个肾小球由突触前标志物VGLUT2的荧光信号界定，肾小球结构周围以虚线标出。在每个肾小球内测量了轴突分选分子的信号强度。

如图所示，轴突分选分子在每个嗅小球中呈差异性表达。例如，嗅小球3中OLPC表达水平较高，Semaphorin 7A表达水平中等，Kirrel2表达水平较低，这种差异可通过测量染色强度进行量化。而嗅小球4中OLPC表达水平较高，Kirrel2和Semaphorin 7A表达水平较低。

同样，这种差异可以通过测量染色强度来量化。在进行该操作时，需要注意省略通常推荐的PFA后固定以及蔗糖溶液处理步骤。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在单个嗅球切片上放置更多的肾小球，以及如何使用多种抗体进行高质量的免疫染色，这些技术也可应用于其他脑区。

不要忘记保持希望，这种方法将帮助您在未来实验中取得成功。