ATAC-Seq 在癌症表观遗传学研究中的优化

ATAC-seq 能够帮助我们识别基因组中开放染色质区域的状态，这种状态在疾病条件下通常与正常状态相比发生改变。该技术具有所需细胞输入量少、Tn5 酶切步骤简化的实验流程、随后通过 PCR 扩增进行片段化 DNA 的分离和文库构建，以及更短的实验周期等优势，因而更具优越性。通过 ATAC-seq 比较正常与疾病状态下表观遗传景观的改变，有助于揭示与疾病相关的染色质调控元件，并为设计新的治疗策略提供有用信息。

该技术操作简便，因为不包含任何关键的实验步骤。要获得成功的ATAC-seq结果，仅需进行几个标准化步骤。首先，从含有每毫升一百万个细胞的PBS细胞悬液中转移25微升至1.7毫升的微量离心管中，在4摄氏度下以500 ×g离心5分钟。

小心弃去上清液，加入 25 µL 裂解缓冲液。轻轻吹打重悬细胞，在冰上孵育 5 分钟。于 4 °C 以 500 ×g 离心 5 分钟，小心弃去上清液。

立即将沉淀重悬于25 µL Tn5反应混合液中，在37°C孵育30分钟，每10分钟混匀一次。向Tn5转座DNA溶液中加入5 µL 3 M醋酸钠和125 µL PB缓冲液。

充分混匀。接下来，将离心柱放入一个2毫升收集管中，并将样品加入离心柱中。在室温下以17,900 ×g离心1分钟，弃去穿流液。

向柱中加入PE缓冲液，离心柱子。将离心柱放回原来的收集管中，离心5分钟以彻底干燥膜。弃去穿流液，将离心柱转移至新的1.7毫升微量离心管中。

用10微升洗脱缓冲液EB洗脱DNA片段，在室温下静置1分钟。然后在室温下以17,900 ×g离心1分钟，以洗脱DNA。在200微升PCR管中建立PCR反应，并进行PCR扩增程序第一部分。

进行实时定量PCR时，通过加入5 µL PCR产物、0.75 µL 1,000倍稀释的SYBR Gold、5 µL 2X PCR主混合液以及3.75 µL无核酸酶水来配制PCR反应体系。根据运行参数确定所需的额外PCR循环次数。确定循环数后，使用先前计算出的额外循环数设置PCR反应。

向扩增的PCR产物中加入150微升磁珠，室温孵育15分钟。将离心管置于磁力架上静置5分钟，小心移除上清液。用200微升80%乙醇洗涤磁珠，然后移除上清液。

完全去除乙醇，并在室温下将样品空气干燥10分钟。最后，用50微升洗脱缓冲液重新悬浮。将离心管置于磁力架上，然后将洗脱液转移至新的1.7毫升微量离心管中。

此处展示了使用台盼蓝比较细胞裂解效率的结果。NMuMG 细胞经低渗缓冲液和 CSK 缓冲液处理后，用台盼蓝染色。在经 CSK 处理的细胞中观察到更高的细胞裂解效率。

ATAC-seq 文库由 MDA-MB-231 乳腺癌细胞制备。PCR 扩增后，在磁珠纯化前后，将 PCR 产物在 0.5X TBE、1.5% 琼脂糖凝胶上进行分析。引物大部分在初始磁珠纯化步骤中被去除。

1X TAE 1%琼脂糖凝胶电泳和自动化电泳的DNA条带模式也已标出。此处显示的DNA片段使用SYBR Gold染色以可视化。同时展示了显示ERS1位点的基因组浏览器轨迹图。

该图像显示了T47D细胞中ATAC-seq数据的基因组覆盖情况。使用了先前发表文献中的引物，其靶向区域以黄色标出。此处展示了一个柱状图，描述了ATAC-seq文库中引物扩增子的富集情况。

ATAC-seq 文库使用低渗缓冲液或 CSK 缓冲液制备。代表性图像显示了 ATAC-seq 优化的基因组浏览器可视化结果。来自 25,000 个细胞起始量条件的 ATAC-seq 数据显示出最高的无核小体片段富集度，而 100,000 个细胞起始量条件则呈现出最高的单核小体 DNA 水平。

此处展示了来自不同细胞数量的ATAC-seq数据的基因组浏览器轨迹。该代表性图像显示了HOMER峰注释分析结果。HOMER将每个峰分类为启动子近端峰或远端峰。

细胞数量、裂解缓冲液的选择以及Tn5酶的浓度等参数取决于细胞类型，是必须标准化的最关键参数。在切割-连接技术中，Tn5与蛋白A融合，广泛用于通过针对目标蛋白的特异性抗体来鉴定该目标蛋白的DNA结合位点。