一种方法的开发 体外 用于研究相互作用的模型系统 马属 caballus IgE 及其高亲和力受体 FcεRI

以下实验的总体目标是测量RAD嗜碱性白血病细胞中IgE依赖性介质的释放量。过敏症状是由组胺等介质释放引起的。组胺并非嗜碱性粒细胞和肥大细胞释放的唯一介质。

这些细胞释放的所有介质的总和导致了速发性和迟发性超敏反应的症状和体征。人类并非唯一遭受过敏困扰的生物，犬类和马类同样会过敏。为了进一步推进研究并开发针对过敏（如疫苗）的治疗方法，需要采用释放检测试验来定量检测研究处理后是否有介质释放及其释放量。

这正是进行此次释放实验的原因。用于人类系统的RBL介质释放实验最初由Ian和Hook于1986年建立并发表。此后该方法被开发用于DOC系统，现在又进一步应用于马系统。

这些修饰仅需更换目标蛋白即可。细胞系为表达马源高亲和力 IgE Fc 受体 Iα 链的大鼠嗜碱性白血病细胞（RBL-2H3.1），细胞密度为每毫升 500,000 个细胞。加入目标 IgE 抗体，使其终浓度为每毫升 1 纳克。

将100微升混合物加入96孔土壤板中，在37摄氏度下孵育16小时。这一步骤可使细胞贴附于孔板表面，同时抗体与其受体结合。随后用100微升预热至37摄氏度的释放缓冲液洗涤两次，以去除未结合的抗体和死亡细胞。

弃去上一次洗涤的缓冲液，加入 100 微升所需浓度的待测抗原。在 37 摄氏度孵育 20 分钟后，将含有释放介质的 SUP natin 溶液 50 微升转移至新的孔中，并将剩余的上清液替换为 50 微升 Triton X 缓冲液，以裂解细胞并释放细胞内残留的介质。加入 50 微升 2 百万摩尔 beta hx。

将底物溶于柠檬酸盐缓冲液中，孵育多日。在37摄氏度孵育两小时后，向每孔加入150微升Tris缓冲液，使孔内溶液变为黄色。16小时后，在405纳米处测定吸光度。

将释放检测缓冲液（也称为 Ian 缓冲液）预热至 37 摄氏度。同时在释放缓冲液中配制抗原的浓度梯度，浓度分别为 0、0.1、1、10、100、1000 和 10,000 纳克/毫升。

然后在37摄氏度下孵育。通过快速弹击培养板以去除培养基，并沿孔壁轻轻加入100 µL预热的释放缓冲液。此步骤旨在减少因温度差异引起的细胞应激，从而避免细胞过早释放介质分子。

该培养皿应清洗两次。弃去最终的释放缓冲液，清洗后加入100微升抗原，从A行的零抗原浓度开始作为阴性对照，然后从B行到G行依次降低浓度梯度，最后在H行加入Triton X片段和缓冲液作为阳性对照。将酶标板在37摄氏度下孵育20分钟。

此时细胞在孵育后释放介质。将每个孔中的50微升液体转移至其对应的孔中。从第7列到第12列，彻底吹打并弃去第1至第6列位置的剩余液体，然后加入50微升Triton X裂解缓冲液。

向培养皿的所有96个孔中各加入50 µL配制好的底物。在37°C下孵育2小时。β-半乳糖苷酶在数天内将底物转化为对硝基苯酚。

孵育结束后，加入150微升Tris缓冲液终止反应，使对硝基苯酚变为黄色。使用酶标仪在405纳米波长下读取酶标板。测定吸光度数据后，通过乘法计算A1孔中细胞内信号分子的总量。

其对应的孔位于 a7×2 位置，将该值与 a1 处的数值相加。这是因为在实验过程中，我们将含有释放介质的样本从 a1 孔转移至新的孔 a7，因此需要进行此计算。

对剩余各孔重复上述计算。通过将A7位置的数值乘以2，计算出孔中释放介质占细胞内总介质的百分比，因为实验过程中我们已获取含有释放介质的上清液。

将样品转移至新的孔中后，将该产物乘以100，再除以对应孔内细胞中该位置的介质总量，从而得到肿胀反应中介质释放的百分比。由于每行中的六个孔均受到相同浓度抗原的刺激，需对剩余各孔重复上述计算，并取平均值。

根据这些数值计算标准差，并将这些数值及其标准差按如下方式绘制成图表。该图表显示，随着抗原浓度的增加，释放的介质逐渐增多，直至达到每毫升100纳克时达到峰值；此后，随着抗原浓度进一步升高，介质释放量反而减少。最终的实验结果应如图B所示。浅蓝色表示的对照释放实验不含IgE抗体，因此随着抗原浓度的增加，介质释放量无明显变化。

与此相比，深蓝色显示的是实验结果，其中可能含有IgE抗体。这是正在测试安全性的抗IgE疫苗的一个示例。从图中红色曲线可以明显看出，抗IgE血清会交联细胞表面的受体，导致RBL细胞脱颗粒，正如紫色所示的阳性对照组结果，而灰色为阴性对照组，表明该疫苗存在安全隐患。

该检测方法非常有用，因为它可以测量介质的释放，或在测试潜在抗过敏药物或疫苗时介质释放的延迟；该方法还可适用于人、犬或马系统。如所示，该检测可用于确定在测试抗过敏抗体时介质释放是否成功被阻断或未能被阻断。