使用激光捕获显微切割结合快速免疫标记法从特定细胞亚群中分离RNA

本实验的总体目标是演示如何对通过激光显微切割（LCM）分离的小鼠脑细胞群体进行快速免疫标记，同时保持样品中RNA的完整性。该目标通过首先快速冷冻已分离的脑组织来实现。随后将脑组织切成薄片并贴附于无RNA酶的玻璃载玻片上，再进行快速免疫染色处理。

最后，使用激光显微切割技术（LCM）分离目标细胞群体。通过快速染色结合激光显微切割，可鉴定实验细胞样本中目标基因表达的变化。该技术相较于现有方法（如荧光激活细胞分选）的主要优势在于，能够保持空间分辨率，从而可从周围组织中精确分离特定的ES细胞。

通常，初次接触该冰冻切片实验的人员会感到困难，因为该操作包含多个关键步骤，需要快速完成以保持样品中RNA的完整性。为准备切片，需在小鼠出生后第一天处死后两分钟内，于冰冻的L-15培养基中解剖出脑组织。随后，将脑组织按适当的切片方向放入包埋模具中，并用冷冻组织包埋剂填充模具。

然后立即将样本在液氮中速冻，并在速冻后30秒内于-80摄氏度条件下保存。现在，对带有膜的玻片进行表面RNA去污染处理，以去除任何微量的RNA残留。用DEPC水冲洗玻片，并在玻片干燥后使其自然晾干。

将冷冻切片机舱室温度设置为零下20摄氏度，并将冷冻样品转移至冷冻切片机中。每个样品均需将冷冻组织块固定于标本夹上，以10微米厚度进行切片，并将切片收集至膜包被的载玻片上。切片在室温下干燥至少10分钟后，使用疏水屏障笔在组织周围画圈。

约10秒后，将载玻片放入新配制的冷固定液中，在负20摄氏度下固定不超过5分钟。随后将载玻片转移至经表面RNA去污染溶液预处理过的洁净托盘中。首先轻摇载玻片一次以去除多余固定液，然后在DEPC处理的PBS中快速浸洗6至8次，并甩去液体。

为去除多余的D-E-P-C-P-B-S，向每个切片中加入200微升一抗溶液。室温孵育10分钟后，将载玻片在D-E-P-C-P-B-S中快速浸洗三次，并轻弹一次以去除多余的洗涤液。随后，在六分钟后，于室温下将样品与200微升二抗溶液孵育。

用DEPC处理的PBS清洗载玻片，方法如前所述，再次快速用DEPC处理的PBS清洗后，将载玻片置于新鲜配制的BC溶液中孵育4分钟。取196微升新鲜配制的DAB与4微升RNA抑制剂混合。在将该溶液加入切片前，先让DAB显色1至2分钟，随后用DEPC处理的PBS洗涤。然后将切片在无水乙醇中孵育数秒进行脱水，并甩干载玻片，以进行激光显微切割（LCM）。

接下来，将RNA提取试剂盒中的50微升裂解缓冲液加入收集管盖中。然后将一张载玻片置于显微镜下，使样品面朝向管盖。选择适合样品的放大倍数，并调节焦距以观察目标细胞。

然后定义切割区域，并使用激光开始切割。将收集到的细胞放入收集管盖中，在42摄氏度下孵育30分钟。在此期间，用250微升平衡缓冲液对RNA提取试剂盒中的RNA纯化柱进行预处理。

然后向柱子上的裂解细胞中加入50微升乙醇，于室温下以16,000 × g离心2分钟，随后用洗涤缓冲液洗涤两次。最后，用推荐的最小洗脱体积11微升无RNA酶的水洗脱RNA，并保留2微升用于检测RNA的质量。这种快速免疫标记方法可在保持实验用RNA完整性的前提下，实现对目标细胞的可视化。

根据实验需求，激光显微切割（LCM）可如上所述用于分离单个细胞或较大的目标区域。降解的RNA会显著影响下游分析的质量。因此，每个样本需进一步在基于微流控X平台的生物分析仪上进行处理，以定量并验证所分离RNA的完整性，方法如上所述。

例如，此处展示了降解样品和高质量样品的典型生物分析仪结果。数字凝胶和电泳图谱确实表明，在每一步溶液中使用RNase抑制剂以保护RNA的重要性。按照本方案获得的高质量RNA可进一步用于下游应用，包括RNA测序、微阵列或定量逆转录PCR。例如，在这些图表中，显微切割样品中TH和AA DC基因表达相对于中脑切片的平均富集倍数超过170倍。

在进行该操作时，重要的是要牢记快速操作，并使用无RNAs的材料。观看本视频后，您应能很好地掌握如何从任何组织中分离出特定的细胞群体。