基于面积的图像分析算法用于定量巨噬细胞-成纤维细胞共培养

该方法可用于帮助研究人员利用简单有效的基于面积的分析手段，对共培养的细胞进行分析和计数。该技术使用广泛可得的软件即可实现，操作相对简便，能够可靠且准确地识别共培养环境中的各类细胞类型。该方法可为特定细胞共培养体系如何协同作用以促进组织再生提供深入见解。

该方法还可用于验证单培养体系下的生物标志物研究。首先，在5毫升细胞培养瓶中加入1毫升DMEM培养基，该培养基需添加胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素、碳酸氢钠和β-巯基乙醇，将264.7巨噬细胞以每平方厘米25,000个细胞的密度接种，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下进行单培养成像。NIH/3T3细胞则在添加10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养。

进行共培养成像时，使用共培养基在不同比例和总密度为每平方厘米25,000个细胞的条件下共同培养RAW 264.7巨噬细胞和NIH/3T3成纤维细胞，共培养基由等体积的RAW 264.7培养基和NIH/3T3培养基混合而成。接种后，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育细胞，使其达到80%的细胞汇合度。使用配备40倍物镜的倒置显微镜采集细胞图像，以评估该算法准确分析不同成像质量图像的能力。

以灰度获取不同焦距下的图像，生成非球状和球状图像，并将其导出为原始 czi 文件。若要使用基于面积的方法获取细胞图像，请将用于分析的图像文件复制并粘贴到 bin 中，并通过执行命令输入文件名。按运行以启动程序。

通过先进行重建开运算，再执行重建闭运算，并使用源函数运行相应命令，从而增强前景与背景的对比度，实现图像分析。采用基于百分位的识别系统对重建后的图像进行二值化处理，通过计算与最大相关像素的百分位差值来区分细胞与背景，其中最大像素值应至少占给定图像的0.5%。对原始264.7巨噬细胞的像素值进行分析与评估，确保其值位于最大相关像素值的4.5%范围内。

然后将该像素标记为细胞。对于包含膨大细胞轮廓的图像，采用迭代程序校正细胞中心处错误的二值化结果。确定细胞总覆盖面积的初始估计值。

运行算法，使用 alpha 和 kappa 的初始估计值分析图像，以填充部分岛状区域。然后利用分析后的细胞计数和覆盖率重新计算 kappa 值。为确定图像二值化后的平均细胞面积，执行命令以获取图像中所有检测到的圆的中心位置和半径向量。

利用半径输出值，通过取平均值计算平均细胞面积，并分析至少10个细胞以确保面积识别的准确性。按照此前所述命令进行图像分析。然后，通过使用raw 264.7和NIH/3T3细胞的图像实验测定参数phi，对含有raw 264.7和NIH/3T3细胞的共培养体系进行分析。

假设一个初始的 phi 值，并进行迭代，直至细胞计数和覆盖面积与原始 264.7 和 NIH/3T3 共培养的手动计数结果高度接近。按照先前单层培养图像的分析方法，确定原始 264.7 细胞在总细胞覆盖面积中的数量。再次分析经过分水岭变换的图像，但不使用 phi 参数，以同时检测巨噬细胞和成纤维细胞。

通过选择性减去使用前述标准阈值法和基于面积的定量方法获得的原始264.7细胞像素，获取NIH/3T3成纤维细胞数据。对非膨大型原始264.7巨噬细胞进行了分析，并记录了算法输出结果。利用该算法对图像进行平均面积计算，共计数226个细胞，而人工计数结果为241个细胞，误差值约为6%。同时对膨大型原始264.7巨噬细胞进行了分析。

使用算法对图像进行平均面积计算，共计数221个细胞，经人工计数验证为252个细胞，误差值约为12%。对同时包含RAW 264.7巨噬细胞和NIH/3T3成纤维细胞的共培养样本进行了分析。算法输出的RAW 264.7巨噬细胞计数为137个，而人工计数结果为155个细胞，误差值约为11%。为评估细胞计数算法的稳健性，采用自动细胞识别与人工计数两种方法对五幅RAW 264.7巨噬细胞图像进行了计数。五幅图像的Dice系数平均参数为0.85。

本方案中的关键步骤是使用基于百分位数的参数，这使得在单培养和共培养图像中均能实现稳健的细胞检测。该方案可用于鉴定目标细胞，进而利用分子生物学技术对共培养体系中定义特定细胞群体的生物标志物及生物标志物的发育进行分析。