一种结合全双侧鳃去神经术的时间差异染色技术用于研究鱼类离子细胞

本实验的总体目标是研究缺乏外源性神经支配的金鱼鳃中鳃细胞的增殖情况。首先将金鱼置于线粒体特异性染料溶液中，以染色已存在的富含线粒体的鳃细胞；第二步是进行双侧鳃部完全去神经手术。

接下来，处死鱼类。采集鳃组织。使用针对钠钾泵的抗体在 TPAs 处标记血细胞。

然后最后一步是对已存在的和新分化的细胞进行成像和计数。最终，这种结合双侧神经支配切除的时间差染色技术可用于展示在无中枢神经系统神经输入的情况下，金鱼鳃细胞的增殖与分布情况。因此，该技术的主要优势在于，可用于理解离子的动态吸收过程，并研究鱼类胃肠道上皮细胞的重新分布。

首先，通过将50微克Mitral Tracker Red溶解于94微升二甲基亚砜中，配制1毫摩尔的储备液，并避光保存。接着，准备3至6个最大容积为600毫升的避光容器，每个容器中加入400毫升系统水，并放入一个充气石，以提供氧气来源。

将重30至40克的金鱼放入盒子中。30分钟后，加入Mitre示踪剂溶液，使终浓度为0.1微摩尔染料和0.01%二甲基亚砜（DMSO）。浸泡鱼类四小时。

四小时后，打开流向盒子的水流，使染料冲洗干净。如果是对照组动物，将鱼恢复饲养三至五天，然后进行免疫组织化学实验；否则直接进行完整的双侧去神经手术。首先，将鱼置于充气的苯佐卡因水浴中，对其进行麻醉。

一旦呼吸停止，将鱼置于手术台上，并将一根导管插入其口腔，以向鳃部灌注充氧的麻醉液。将鱼体摆放成头部略微向下倾斜的姿势，以便更好地接触第四鳃弓后方区域。使用标准直头镊子轻轻抬起鳃盖，然后将组织牵开器置于鳃盖与头部内侧之间。小心地撑开组织牵开器，使鳃盖远离头部，从而持续暴露鳃组织。

将牵开器手柄置于头部旁边，以暴露全部四对鳃弓。检查麻醉液是否正在灌流鳃部，并将弯型或直型标准图案镊子插入第四鳃弓与头后部之间。轻轻打开镊子，以在韧带上产生张力。

使用5号镊子将第四鳃弓与头部连接。用穿刺法在上皮组织上造一个2至3毫米的开口，将鳃弓的背侧末端与耳囊腔相连。注意不要刺入过深，以免损伤主要血管。

接着，用五号镊子夹住一小棉签，小心地扩大切口以暴露第九和第十对神经。用五号镊子将神经从周围结缔组织中分离出来，注意再次避免损伤血管。

神经暴露并识别后，用弯头弹簧剪在保持切口张开的情况下小心剪断神经。使用直头标准形状镊子进行撑开。切断神经后，轻轻撤回弯头镊子，并移除组织。

由于切口在24至48小时内可自行闭合，因此无需使用牵开缝线。在头部另一侧重复上述操作后，将鱼鳃的灌流液从麻醉剂更换为新鲜的充气水，并让鱼从麻醉状态中恢复。一旦鱼的耳石运动恢复，立即将鱼转移至实验用鱼缸中，使其至少恢复24小时。

最后，对另一组鱼类进行假手术操作：在处死鱼类前，刺穿第四鳃弓后方的上皮组织，但不切断神经。向闪烁计数瓶中加入 3 至 4 毫升的 4% PFA，每个鳃弓使用一个计数瓶。

此外，取一个小型浮舟，加入 1 mL XPBS。该溶液将用于组织切除后的清洗。所有溶液均需置于冰上保存。

用过量的苯佐卡因处死鱼类后，使用钝头镊子抬起头部一侧的鳃盖，再用弯头剪刀切断鳃篮的每一端。接着，用钝头镊子小心地夹住鳃丝，将鳃从鳃腔中取出。立即将鳃放入冰冻的1×PBS中清洗，以去除多余的苯佐卡因和血液，并将切除的鳃放入装有4%多聚甲醛（PFA）的离心管中，于4°C固定过夜。

用一毫升XPBS洗去X-S-P-F-A，将组织放入装有1.5毫升1% Tritton X的2毫升子弹管中。将子弹管置于摇床上，室温孵育6小时或4°C过夜。为使组织通透，通过将4微升NKA和ZN 12一抗分别加入992微升1×PBS中，配制每种一抗的1:250稀释液。

确保两种一抗均来自同一宿主。吸去 Triton X 溶液后，无需先洗涤组织，直接加入一抗溶液，在室温下于摇床上孵育六小时，或在 4 摄氏度下孵育过夜。孵育结束后，吸去一抗溶液，用洗涤液将一抗洗涤三次，每次三分钟。

使用1× PBS。将5微升原液二抗加入995微升1× PBS中，配制成1:200稀释的二抗溶液。最后一次洗涤后吸去PBS，加入二抗溶液，在摇床中室温孵育6小时或4°C过夜。

最后，如前所述，用 PBS 缓冲液洗涤组织三次，每次五分钟，以去除多余的二抗。洗涤后，将组织置于载玻片上：先在平的显微镜载玻片上放置一滴 200 微升的 1×PBS 缓冲液，将鳃组织放入其中，以防止组织干燥。用弯头显微剪刀将鳃的半鳃片分开。

然后，在凹面载玻片的凹槽内分别加入一滴 XPBS 和一滴封片介质。将分离的半侧卵巢组织放入凹面载玻片中，使滤泡的前端朝上，盖上盖玻片，并用指甲油轻轻涂抹盖玻片边缘进行封固。为防止盖玻片移动而导致组织移位，在成像前需让组织沉降到凹面载玻片底部，静置 10 至 15 分钟。

对于每个鳃弓，随机选取六根鳃丝进行成像，每个鳃弓获得六张图像。采用常规共聚焦显微镜对组织进行成像，获取厚度为1至3微米的光学切片。在下述图像中，由箭头指示的细胞经α5抗体染色，箭头所指的神经经ZN-12抗体染色。此图为对照组鱼类鳃丝的共聚焦图像，显示了外源性神经支配，中央神经束在鳃小片区域呈现广泛的分支，推测起源于第九和第十脑神经，如插图所示。

部分所示的细胞也受到神经支配。该图像显示全双侧去神经支配两天后的鳃丝。中央神经束有所减少，而小叶的神经支配似乎基本保持完整。

此处显示的是完全双侧去神经支配五天后的鳃丝，表明鳃的外在神经支配目前已基本消失。定性分析表明，完全双侧去神经支配会导致鳃外在神经支配的退化，同时保留胞体位于鳃丝内部的神经，从而在鳃丝内及至鳃小片中形成神经网络。该方法可与其他技术结合使用，例如测量离子流，或利用放射性离子（如钠-22）来回答更多研究问题。