基于光电二极管的光学成像技术用于在非转基因无脊椎动物中以单神经元分辨率记录神经网络动态

本文详细描述了如何使用光电二极管阵列和电压敏感染料同时记录大量神经元的动作电位。与间接反映神经活动的钙成像相比，我们所使用的电压敏感染料能够直接记录动作电位，其原理类似于尖电极记录，但可同时在多个神经元上进行。我们的光学成像工作流程可被快速应用于多种非转基因无脊椎动物甚至脊椎动物系统，以单个神经元和单个动作电位的分辨率可视化神经网络活动。

此外，本方案中的操作步骤将由我实验室的Evan Hill进行演示。首先，麻醉一只重40克的加州海兔（Aplysia californica），将其腹面朝上固定于涂蜡的解剖皿中。使用解剖剪，在足部最前端沿中线做一条2至3厘米长的切口，并将切口两侧的足瓣固定，以暴露部分中枢神经系统和口球结构。

使用镊子和解剖剪仔细分离口器团块，暴露脑神经节，并切断支配动物身体的神经，以摘除中枢神经系统，保留一段较长的神经用于刺激。使用微细固定针将中枢神经系统固定在盛有生理盐水的弹性材料衬里培养皿中，并通过帕尔帖冷却装置冷却的生理盐水持续灌流，使标本温度维持在 15 至 16 摄氏度。使用镊子和显微解剖剪去除神经上的多余结缔组织，并剥离待成像神经节或神经节群表面的一部分鞘膜。

然后将清洗后的中枢神经系统浸入含有0.5%戊二醛的生理盐水中固定20秒，随后将中枢神经系统放回盛有生理盐水灌注的弹性衬里培养皿中，以洗去多余的戊二醛。为配制电压敏感染料工作液，向预先分装好的RH 155固体中加入500微升生理盐水，使染料终浓度为0.3毫克/毫升。使用手持式微量移液器将200微升溶液加入一段聚乙烯管中，该管直径应与待染色的神经节相近。

使用显微操作器，小心地将管子末端置于目标神经节上方，缓慢下降管子，直至其与神经节形成紧密密封。在一小时内每隔五分钟转动一次微量分配器施加装置的旋钮，以推动更多染料覆盖神经节，并在30分钟时检查样品，确认染色充分。染色完成后，在保持光线昏暗的条件下，在含盐溶液的成像室中放置标本的位置左右两侧各放置适当的缓冲材料，然后将中枢神经系统浸入成像室中。

将一块大小合适的盖玻片压在组织上，并用力按压盖玻片，使组织展平，同时避免损伤神经元。然后将成像室置于解剖显微镜下。若需刺激神经以诱发虚拟运动程序，请在火焰上小心熔化一段PE100聚乙烯管，同时轻轻牵拉管段两端，随后在所需位置剪断形成的锥形部分。

接着，将一段厚壁柔性聚合物管连接到聚乙烯吸吮电极的后端。然后使用吹嘴部分产生负压，使少量生理盐水通过吸吮电极的锥形末端被吸入。在显微镜下将待刺激的神经末端吸入电极内，并确认电极内的生理盐水中无气泡，以免干扰电传导。

为成像神经节，将记录室移至成像装置，并通过记录室启动生理盐水灌流。将温度探针置于标本附近，并根据所成像物种的需要设定适宜温度。将一根氯化银导线插入吸电极内，确保其与电极内的生理盐水接触，同时将另一根银/氯化银导线放入靠近吸电极的浴槽生理盐水中。

将水浸物镜浸入盐水中并关闭基座光圈。升降聚光镜并调节焦距，直至光圈边缘清晰对焦，形成科勒照明。对准待成像的标本区域，使用齐焦数字相机采集目标神经节的图像。

将控制面板的增益开关设置为1X，然后单击静息光强度按钮，以检查二极管的平均静息光强度。调节从刺激器发送到LED灯电源的电压水平，并持续检查平均静息光强度，直至其处于所需范围内。然后将控制面板的增益开关设置为100X以进行记录，并再次确认弹簧台或气浮台处于浮动状态。

在保持灯光昏暗的条件下，于成像软件中设置文件持续时间、保存路径和文件名，然后点击“采集数据”以开始采集，直至达到计算机可用内存的容量上限。记录过程中务必保持静止，因为微小的振动可能在光学记录数据中引入显著的伪影。采集完成后若需立即查看数据，可使用叠加功能，将全部464个二极管采集的数据叠加显示在神经节图像上，并点击软件中任一二极管以在独立的轨迹窗口中展开查看其记录的数据。

为了实现二极管相对于样本的精确定位，请输入通过针孔测试确定的X、Y坐标及放大倍数参数。为了最大限度提高动作电位的可见性并提升后续 spike sorting 的神经元信号产量，应施加一个截止频率为5赫兹和100赫兹的带通巴特沃斯滤波器，以去除低频和高频噪声。若要将滤波后的光学数据保存为文本文件以供后续分析，请在页面屏幕上选择TP滤波框。

在输出选项卡下，选择“将页面另存为ASCII”。然后在出现的对话框中输入合适的文件名。其海星捕食者的接触会触发狄氏海牛（Tritonia diomedia）的逃生游泳行为，表现为一系列有节律的全身屈曲运动，推动其远离危险以确保安全。

在此图中，展示了20个二极管在刺激足神经三之前、期间和之后记录的原始数据和滤波后的数据。采集后可立即在成像软件中将记录阵列的全部464个二极管所测得的信号以拓扑方式叠加显示在标本图像上。在本分析中，通过对滤波后的二极管信号进行基于独立成分分析（ICA）的脉冲分类，共得到53条独特的神经元信号轨迹，其中30条在此展示。

对加州海兔施加强烈的厌恶性尾部刺激，会引发一系列重复的两段式节律性逃避反应，该反应包括数个周期的快速头部前冲和尾部收缩，使动物迅速向前移动，随后进入爬行阶段。在此代表性分析中，在持续20分钟的光学记录进行到第1分钟时，对第九对足神经进行刺激，以诱发快跑-爬行运动程序序列。所有81个记录神经元信号的概率性高斯空间分布被映射到神经节上。

对完整记录数据应用降维分析后发现，逃避行为程序中的疾跑和爬行阶段在主成分空间中占据不同的区域，并形成不同的轨迹。在实施该方案时，需重点考虑以下因素：优化染色效果、尽量减少振动，以及在尽量降低荧光染料光漂白的同时，将足够的光线引导至光电探测器。一些获取数据后的分析示例揭示了群体水平的网络特征，包括通过无监督学习算法中的共识聚类进行功能集群检测，以及利用主成分分析进行降维处理。

基于光电二极管阵列的成像系统与吸收性电压敏感染料的结合，使长时间动态监测网络演化成为可能。