基于聚丙烯酰胺的简易多孔硬度检测法用于研究细胞对基质硬度的依赖性反应

本实验的总体目标是实现一种快速、高效且低成本的多孔板形式聚丙烯酰胺凝胶制备方法。该方法首先将凝胶前体溶液夹在经疏水涂层处理的玻璃板与具有丙烯酰胺粘附性的柔性塑料支撑膜之间；第二步是在聚合完成后，将凝胶从玻璃板上剥离，此时凝胶已共价结合于柔性塑料支撑膜上，随后使其干燥。

接下来，将干燥的凝胶及其下方的柔性塑料支撑材料切割成所需的形状，并将塑料面朝下粘附到多孔板或其他细胞培养容器的孔底。最后一步是用细胞黏附性涂层（如I型胶原单层）对组装好的多孔板中的聚丙烯酰胺凝胶进行包被。最终利用显微镜及其他细胞表征技术，观察底层聚丙烯酰胺基质对细胞的影响。

特别是其刚度对细胞行为的影响。与现有方法相比，该方法的主要优势在于能够以低成本且高效的方式处理任意刚度和厚度的聚丙烯酰胺凝胶，并可在多孔板中进行组装，这是其他方法所不具备的。演示该实验流程将由我实验室的一名学生完成。

首先，通过混合丙烯酰胺、交联剂双丙烯酰胺和去离子水来制备聚丙烯酰胺凝胶前体溶液，并将Sul OPA溶解于二甲基亚砜中，配制成50毫克/毫升的溶液。取20微升该储备溶液分装至10个微量离心管中。然后将溶液在液氮中迅速冷冻，并于-80°C保存。

接下来，将过硫酸铵溶解于去离子水中，配制浓度为10%（重量/体积）的过硫酸铵溶液。取25微升该过硫酸铵溶液分装至10个微量离心管中，并于-20摄氏度保存。通过将I型胶原原液在pH 7.4的1倍PBS缓冲液中稀释，配制0.2毫克/毫升的胶原溶液。

所有溶液在使用前均需置于冰上保存。此时，在玻璃片上滴加数滴疏水性溶液，并用纸巾将其均匀涂抹至整个表面。待玻片自然风干后，再次用纸巾擦拭，以使疏水涂层分布均匀。

将一块柔性塑料支撑材料裁剪至与疏水涂层玻璃板相同的尺寸。然后用锋利的工具（如手术刀）在柔性塑料支撑材料的疏水表面轻轻划痕，以标记其疏水面。进行凝胶制备时，将4972.5 µL所需终浓度的聚丙烯酰胺前体溶液加入一个50 mL的锥形管中。

将离心管放入脱气室中，管盖打开，脱气30分钟。随后，向之前配制的DGAs凝胶溶液中加入25 µL过硫酸铵溶液，使过硫酸铵的终浓度为0.05%。然后加入2.5 µL TM me，使TM me的终浓度为0.5%。用移液器轻轻吹打溶液3至5次，使其充分混匀。接下来，将所需厚度的硅胶垫片放置于柔性塑料支撑材料的亲水面一侧。

然后将凝胶溶液用移液器滴加到间隔片之间的柔性塑料支撑物上，并用涂有疏水层的玻璃盖片封片。室温静置45分钟使凝胶聚合后，将带有共价结合的聚丙烯酰胺凝胶的柔性塑料支撑物剥离下来，胶面朝上放置使其自然风干。干燥后，将聚丙烯酰胺凝胶切割成所需的形状。

根据生产商说明书，为每块 96 孔板准备约 500 微升的 Polymethyl soane，用于将凝胶粘附至多孔板底部。使用镊子在每个孔的中央放置一小滴 Polymethyl soane。将一块聚丙烯酰胺凝胶柔性塑料支撑面朝下放入每个孔中。

聚二甲基硅氧烷固化后，用移液管将先前制备的纤维素溶液少量加入每个孔中，并左右轻轻摇晃，使凝胶表面均匀覆盖。将孔板置于高强度紫外灯下照射五分钟。完成后，用PBS冲洗凝胶以去除多余的纤维素。

用移液器向每个孔中加入约 50 µL 前述制备的 I 型胶原溶液。用 PBS 洗涤以去除多余的胶原溶液后，将培养板在室温下静置至少 2 小时，并保持盖好状态。将凝胶置于生物安全柜中，用紫外光照射 2 小时以进行灭菌。

最后将凝胶浸泡在完全培养基中过夜，以充分水化和平衡。凝胶制备后应立即用于细胞接种，或在冰箱中保存最多两天。不同丙烯酰胺和双丙烯酰胺浓度（分别记为 A 和 B）下的杨氏模量随其变化的关系如图所示，符合预期。

储存模量 G' 和损耗模量 G'' 均与频率无关。研究还证实，将凝胶干燥后再重新水化，不会影响其杨氏模量。通过使用交联剂 Sulo sampa，可在任意刚度的水凝胶上实现均匀的胶原蛋白包被。

观察发现，当乳腺癌 M-D-A-M-B 2 31 细胞在聚丙烯酰胺凝胶上接种培养 24 小时后，在较软的 0.5 和 1 千帕凝胶上细胞保持圆形，但在较硬的 100 千帕凝胶上能够铺展并伸长。此外，制备在柔性塑料支撑材料上的水凝胶具有透明性，便于观察和显微成像。同时，该柔性塑料支撑材料无自发荧光，因此不会干扰荧光标记细胞的成像。

细胞形态进一步通过细胞整体铺展面积和细胞圆度进行量化。观看本视频后，您应能充分了解如何以高效且低成本的方式在多孔板中组装聚酰胺凝胶，用于研究依赖于刚度的细胞生物学。