利用基于丙烯酰胺的水凝胶研究基质刚度对细胞功能的影响

使用丙烯酰胺水凝胶模拟体内组织顺应性。该过程首先制备具有反应性的底部盖玻片和硅化处理的顶部盖玻片。实验的第二步是倾注并形成丙烯酰胺水凝胶。

该实验步骤的第三步是将选定的细胞外基质蛋白交联到水凝胶上。最后一步是细胞的孵育与分析。最终，可通过免疫荧光显微镜、实时定量 PCR 和蛋白质印迹等分析方法获得结果，以显示体外不同细胞外基质刚性如何调控细胞行为。

今天我们将向您展示丙烯酰胺水凝胶的制备与使用方法。在我们的实验室中，利用该方法研究细胞外基质刚度如何调控细胞形态、细胞信号传导及增殖。现在就开始吧。

开始此实验步骤时，首先制备活化的盖玻片。先将一层对苯二甲醛（paraform）置于直径150毫米的培养皿下半部分。然后将最多九片25毫米的经高压灭菌的盖玻片转移至对苯二甲醛膜上，并加入1毫升0.1摩尔的氢氧化钠溶液覆盖盖玻片。

将盖玻片孵育三分钟。孵育结束后，在通风橱中使用真空管线吸除氢氧化钠，然后用移液器向每张盖玻片上加入0.5毫升三氨基丙基三甲氧基硅烷（3-A-P-T-M-S）。再次将盖玻片孵育三分钟，随后吸除3-A-P-T-M-S。注意避免孵育时间过长，以防盖玻片表面产生泡沫。

处理后的盖玻片。在同一培养皿中用20毫升去离子水冲洗盖玻片一次。用弯头镊子将盖玻片从培养皿中取出，并转移至新的150毫米培养皿中，确保处理面朝上。

然后再次用去离子水清洗盖玻片，并将其置于摇床上振荡10分钟。孵育结束后，移除水分并再清洗两次。必须彻底清除所有三甲氧基硅烷（A-P-T-M-S），以防止其与戊二醛发生反应，在使用戊二醛前10分钟产生浑浊的白色沉淀。

使用弯头镊子将盖玻片转移至一个干净的培养皿中，该培养皿底部铺有帕拉膜（param），然后用真空泵吸除残留液体。使用真空管线吸去剩余液体后，每张盖玻片上完全覆盖0.5毫升0.5%戊二醛的无菌去离子水溶液，以交联三层A-P-T-M-S和聚丙烯酰胺凝胶。将盖玻片在化学通风橱中孵育30分钟。随后吸除戊二醛溶液，并再次用去离子水洗涤盖玻片。

然后将盖玻片完全干燥。将新的盖玻片加入含有氯仿中10%表面封固液的50毫升Falcon管中，至少摇动10分钟。倾去表面封固液，空气干燥。

在生物安全柜内的 Kim 擦拭布上放置盖玻片，准备开始制备水凝胶。使用弯头镊子将盖玻片有反应活性的一面朝上转移至一张已用胶带固定在生物安全柜表面的多聚甲醛膜上。确保盖玻片平整地贴附在多聚甲醛膜表面。

然后，通过将少量 NHS 溶解于足量甲苯中，制备饱和且含羟基的 CIN 助剂或 NHS 溶液。对于特定实验，持续加入少量 NHS 直至不再溶解为止。该饱和溶液通常呈浑浊且微粉红色。

接下来，配制丙烯酰胺、BIS 丙烯酰胺、水和 PS，以达到所需的丙烯酰胺百分比。按照书面实验方案中所述，将试剂依次加入微量离心管中。每次加入一个等分试样。

加入NHS和TM me。短暂涡旋混匀试管，立即在生物安全柜中将混合液分装到3至5个盖玻片上，每个盖玻片使用140 µL。在凝胶开始聚合之前，迅速将硅化处理的25 mm盖玻片放置于每个凝胶上方。

加盖上层盖玻片可使丙烯酰胺完全覆盖下层盖玻片。将此夹心结构在室温下孵育，直至丙烯酰胺聚合，以确定聚合是否完成。检查微量离心管中残留的丙烯酰胺溶液。

聚合过程对于较硬的凝胶需要几分钟，而对于较软的凝胶则需要稍长一些时间。聚合完成后，戴上无菌手套小心地拿起凝胶夹心结构，然后将顶部盖玻片轻轻滑动，使其悬伸出聚合后的凝胶边缘。

然后撬开盖子，取下凝胶，丢弃顶部的盖玻片。将每个底部的凝胶盖玻片（此后称为水凝胶）放入六孔板中。

接下来，向六孔板的每个孔中加入两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。然后用 PBS 清洗水凝胶，并在摇床上孵育五分钟。重复此清洗步骤两次。

实验开始时，将两毫升纤连蛋白溶液或其他细胞外基质蛋白覆盖于每种 hydrogel 上。在 4 摄氏度条件下孵育过夜，使蛋白与 hydrogel 发生共价结合；过夜孵育后，吸除 ECM 溶液。随后，用含有每毫升一毫克经加热活化的无脂肪酸牛血清白蛋白的无血清培养基封闭未反应的 NHS 位点，在 37 摄氏度下孵育至少 30 分钟。

孵育结束后，用无菌 PBS 清洗水凝胶一次。随后将细胞接种于含有胎牛血清的适当培养基中，并接种到水凝胶上。

使用已建立的小鼠胚胎成纤维细胞。根据实验所需的细胞铺展程度和汇合度，确定接种在水凝胶上的细胞数量。进行蛋白质印迹和定量PCR分析大约需要10的5次方个细胞。

然后在适合特定细胞类型的条件下孵育细胞。孵育结束后，根据需要提取细胞蛋白或 mRNA。

在实验台上的多聚甲醛板上滴加100微升裂解缓冲液液滴，每个液滴之间间隔约2至3厘米。接着，小心地通过提起孔中底部的盖玻片来取出每块水凝胶。使用弯头镊子，将水凝胶的细胞面朝下放置于液滴上方。

将细胞与裂解缓冲液孵育，时间精确为一分钟。最后，移除盖玻片，并将裂解缓冲液转移至微量离心管中。或者，在提取RNA时，将每个水凝胶转移至新的六孔板中，并向每孔加入1毫升三唑试剂。

孵育凝胶三分钟后，将三唑溶液移除并储存于微量离心管中。在加入 A-P-T-M-S 后彻底清洗盖玻片，是制备反应性盖玻片的重要步骤。

清洗并干燥得当的盖玻片应无任何沉淀残留。A-P-T-M-S 会与戊二醛反应，产生白色浑浊沉淀。若出现沉淀，则必须重复整个步骤，因为该盖玻片已不可用。

水凝胶形成并包被细胞外基质蛋白后，接种细胞并培养过夜。细胞在硬质与软质水凝胶上的铺展程度存在明显差异，这一点可通过染色中的折叠形态观察到：小鼠胚胎成纤维细胞在硬质水凝胶上的铺展程度明显大于在软质水凝胶上的铺展。事实上，大多数附着于软质水凝胶的细胞将保持较为紧凑的形态，且附着效率较低。

小鼠胚胎成纤维细胞中周期蛋白D1 mRNA水平的代表性定量PCR结果显示，在刚性基质上周期蛋白D1显著上调，而在柔软基质上则无此现象。这表明基质刚度可在体外调节细胞周期进程。我们刚刚向您展示了如何制备具有不同刚度的水凝胶，以模拟体内生理条件。在进行该实验时，务必记得多制备一些活性盖玻片，因为操作过程中难免会发生意外或错误。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。