单细胞硬度趋性实验用于评估细胞运动及相关信号事件的力学调控

人们日益认识到机械微环境对细胞信号传导和迁移的重要影响，因此需要采用独特的实验方法对单个细胞施加机械刺激。该技术能够实时动态调控细胞下方的机械微环境。

通过该方法可观察细胞迁移行为及亚细胞信号事件中受力学调控的变化。本次实验操作由本实验室的博士后Nyla Naim和技师Johnathan Patterson进行示范。首先使用Chorono-1对每个底部盖玻片的玻璃表面活化20秒，随后立即在每个盖玻片上覆盖50 µL的bind silane工作液。

让溶液干燥10分钟，然后用95%乙醇冲洗盖玻片两次，再用异丙醇冲洗两次。随后，让盖玻片在空气中干燥约20分钟。对于荧光微珠的沉积，首先将工作用微珠溶液超声处理一小时。

超声处理结束前15分钟，将活化的盖玻片垂直放入陶瓷盖玻片架中，并将支架转移至台式等离子清洗仪中，用空气等离子体处理3分钟。接着，将石蜡膜小片放入60毫升培养皿盖中，并将盖玻片放置在膜上，轻轻敲击每片盖玻片，确保膜与盖玻片之间接触良好。然后，向每片盖玻片表面加入150微升工作浓度的微珠溶液，并立即从盖玻片侧面抽吸乙醇溶液，使微珠保留在盖玻片上。

制备水凝胶后应立即进行包埋，取25微升水凝胶溶液滴加至底部盖玻片的活化面，随后立即将带有微珠的顶部盖玻片（微珠面向下）翻转并覆盖在液滴上。让凝胶聚合30分钟，然后用镊子轻轻取下盖玻片。接着，用新鲜的50 mM Hepes缓冲液洗涤凝胶，每次洗涤5分钟，共洗涤三次。

为激活水凝胶表面，将凝胶置于新鲜的50 mM Hepes中孵育，并加入0.4 mM Sulfo-Sanpah，在封闭区域中立即用紫外弧光灯照射90秒。激活结束后，用新鲜Hepes溶液洗涤凝胶三次，每次5分钟。随后将激活后的水凝胶与20 µg/mL纤连蛋白在37°C孵育1小时。孵育结束后，吸除多余的纤连蛋白溶液，并用PBS洗涤凝胶三次，每次5分钟。

最后一次洗涤后，将水凝胶置于少量磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在超净台内用紫外光照射15分钟以对凝胶进行灭菌。随后，用新鲜PBS洗涤凝胶一次。进行细胞接种时，每块水凝胶中加入3毫升培养基，其中含有2.1 × 10⁴个目标细胞，并在37 °C条件下孵育4至18小时，使细胞贴壁。

在细胞平衡的同时，使用显微拉针仪将一根直径为1毫米、长度为100毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成显微电极，使其形成超过2毫米的锥形部分，前1毫米处直径逐渐缩小至约50微米，并在末端1毫米处延伸为长而平行、直径为10微米的管状结构。接着，将该电极装入显微成型仪中，将其尖端塑造成钝形，最终形成一个长度为250微米、末端封闭且直径为15微米的尖端，该尖端部分相对于电极主体弯曲约35度角。弯曲处的直径应约为30微米，以增强尖端的机械强度。

接下来，将水凝胶放置在倒置显微镜的载物台上。用矿物油覆盖培养基，并选择10倍物镜。用70%酒精对制备好的微移液管进行灭菌。

然后，将微移液管插入移液管架中，使钩端朝向培养皿，并使用粗调操纵器降低移液管，直至钩端刚好接触液面。将显微镜聚焦于附着在凝胶顶部的细胞上，并注意物镜不会触碰到样品或载物台，将焦平面移至凝胶上方以找到微移液管的尖端。旋转移液管，使其尖端与焦平面垂直，使微移液管的钝化尖端朝下，并根据需要重新对焦于移液管尖端。

将焦点重新下移至细胞层，以判断移液管距离凝胶表面的远近，再将焦点上移至凝胶与移液管尖端之间的中间平面。然后缓慢降低移液管，使其到达该中间焦平面，并将放大倍数调整至实验中将使用的倍数，随后继续降低移液管，直至其恰好悬停在水凝胶表面的上方。进行微操作器校准时，需依次采集以下区域的图像：无细胞区域、含微珠但未进行操作的区域、移液管接触凝胶的区域，以及移液管牵拉凝胶时的区域。

然后，使用 ImageJ 比较无微珠区域、未结合状态下的微珠区域、凝胶结合后的微珠区域以及被拉伸的凝胶，以计算微珠的相对位移及施加在凝胶上的力。为进行刚度趋向性（durotaxis）检测，需监测一组细胞 30 分钟，以识别出呈定向移动的细胞。选择一个稳定朝单一方向移动的细胞，并以所需的帧率继续监测该细胞额外 30 分钟。

接下来，将移液管置于所选细胞前缘近端约50微米处，移动显微操作仪，使凝胶沿细胞运动方向的垂直方向发生形变。随后，随时间观察细胞对玻璃微移液管施加的局部、急性水凝胶硬度梯度的响应。采用此技术时，大鼠胚胎成纤维细胞会向硬度增加的区域迁移。

在125千帕的聚丙烯酰胺凝胶上瞬时表达维甲蛋白张力传感器的大鼠胚胎成纤维细胞，也表现出在拉伸方向上于40分钟内形成局灶性黏附。荧光共振能量转移分析显示，当受到急性硬度趋化刺激时，定位于局灶性黏附的维甲蛋白张力发生即时变化。该检测方法的应用可进一步扩展至观察细胞内信号事件对硬度趋化刺激的响应。

如果对一个细胞进行多次拉伸尝试，或在实验过程中微针发生滑脱，请更换新的细胞重新开始实验，以避免施加多次且不一致的机械刺激。除了用于检测细胞对基质硬度的趋向性（durotaxis）外，该技术还可与遗传学方法结合使用，例如生物传感器、RNA干扰（RNAi）或基因编辑技术，以帮助阐明机械信号转导过程中的分子机制。