出生后心肌细胞细胞周期变异的可视化及核形成确定

本实验的总体目标是可视化出生后心肌细胞的细胞周期活性，并确定其核型特征。该方法有助于回答心脏再生领域中的关键问题，例如：心肌细胞是否真正发生分裂，还是仅仅增加了其倍性或转变为多核状态？该技术的主要优势在于，能够以高时空分辨率可视化细胞周期的M期，并可通过荧光识别心肌细胞的细胞核。

本实验操作将由本实验室的技术员 Patricia Freitag 演示。若使用非纯合子交配对，首先需通过荧光显微镜鉴定转基因心脏，以检测其 EGFP analin 和 H2B-mCherry 的表达情况。通过聚焦心房组织的不同层次，可在心房边缘最清晰地观察到 EGFP analin 的细胞核信号。

为了分离心肌细胞，将适量的心脏放入含有1毫升新生小鼠心脏解离试剂盒酶混合液的1.5毫升反应管中，并用剪刀将心脏剪成小块。然后，将溶液转移至15毫升反应管中。将反应管置于接近水平的位置，在37摄氏度下孵育15分钟，孵育结束时用5毫升移液器吹打组织5到10次以混匀。

第三次消化结束时，加入7.5毫升培养基二终止反应，并通过70微米细胞滤网过滤细胞悬液。用3毫升培养基二冲洗细胞滤网，将洗涤液与收集的细胞合并，离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于500微升培养基一中，进行计数。

然后，将一乘以十的四次方个细胞接种到96孔平底板中，每孔加入120微升培养基一，并在细胞于细胞培养箱中过夜培养前进行离心。次日，大多数心肌细胞应已开始搏动。开始转染前，使用RNA酶去污染溶液擦拭实验台面及所有转染用材料，以去除任何RNA酶。

当所有材料准备就绪后，向每个孔中加入 20 微升 freshly prepared siRNA 混合液，并将细胞放回培养箱中孵育 48 小时。两天后，将每孔中的上清液更换为 120 微升 medium one，并将细胞放回培养箱中继续孵育至少 24 小时。孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞一次，随后用 4% 多聚甲醛溶液固定 20 分钟。

为了通过共聚焦视频显微镜分析细胞，将培养板转移至共聚焦显微镜载物台上，并启动成像软件。打开 A1plus 设置，选中通道一、通道二、通道三和通道四的复选框。在下拉菜单中，将通道一设置为 DAPI，通道二设置为 eGFP，通道三设置为 RFP，通道四设置为 Cy5。

单击通道电压，使用滑动条将每个通道的电压设置为80。使用滑动条将偏移量设为零，然后单击“归位”按钮，将针孔设置为初始位置。在下拉菜单中将扫描尺寸设置为1024 × 1024像素。

单击“优化”以打开 XYZ 尺寸设置窗口，并在建议的 Z 步长下勾选理想的体素框。选择 20 倍物镜，并调节激光强度，直至图像既不欠曝光也不过曝光。当所有参数设置完成后，打开采集菜单。选择“扫描大图像”，然后在区域选项下选择“当前位置为左上角”。

然后将X和Y方向的视野数设置为3×3，点击扫描。为确定心肌细胞核的数量，点击测量、手动测量和计数。选择具有H2B-mCherry信号的细胞核，从而对其进行标记和计数。

然后，选择α-肌动蛋白in阳性细胞以确定心肌细胞的数量。为了计数处于G1期、S期和G2期且具有核EGFP-analin信号的心肌细胞，请选择“测量”、“手动测量”和“计数”功能。通过点击标记表达EGFP-analin和H2B-mCherry的细胞核，并手动计数具有有丝分裂特异性EGFP-analin信号（如收缩环和中间体）的心肌细胞。

然后，点击“测量”、“手动测量”和“计数”，并标记具有有丝分裂特异性 EGFP analin 信号、胞质信号、收缩环以及中间体的心肌细胞。与阴性对照相比，转染 miRNA 和 siRNA 的心肌细胞显示出细胞周期活性的增强。进行内复制的心肌细胞仅表现出细胞核内的 EGFP analin 表达，而正在进行细胞分裂的心肌细胞则在 M 期典型的定位中显示 EGFP analin 表达。

在Langendorff装置中对心脏组织进行酶消化后，可将心房和心室进行机械分离并独立分析，从而能够观察到H2B-mCherry转基因心室心肌细胞，其中含有大量H2B-mCherry阳性双核心肌细胞。相比之下，大多数心房心肌细胞为单核。酶消化不会产生100%的单细胞群体，通过α-肌动蛋白染色可显示出横纹结构模式，这进一步有助于区分双核心肌细胞（呈现连续的横纹结构）与细胞双联体。

为了分析厚切片中心肌细胞的双核指数，有必要手动浏览图像堆栈，因为细胞核不一定位于同一个Z平面上，而麦胚凝集素染色有助于识别细胞边界。通过对成年转基因小鼠心脏固定切片进行三维重建，可检测并自动计数肌钙蛋白钩状结构、染色阳性以及H2B-mCherry阳性细胞核，从而确定组织中心肌细胞核在生理条件下的比例。一旦掌握操作技巧，心脏解离过程若操作得当，可在两至三小时内完成。

在进行该实验操作时，必须始终连续操作，以确保细胞在整个实验过程中保持活性。通过本实验步骤，可筛选microRNA或其他小分子物质对出生后心肌细胞增殖作用的影响。