一种快速可靠的细菌转录组分析流程 案例研究：丝氨酸依赖性基因调控 肺炎链球菌

本实验的总体目标是概述细菌在特定条件下发生的转录组变化。首先在特定条件下培养并收获细菌细胞，随后从收获的细胞中提取总RNA，并以该RNA为模板合成cDNA。

然后将cDNA进行标记，并杂交到实验室自制的微阵列芯片上。最后，芯片经过洗涤后进行扫描和分析。最终，利用微阵列技术展示细菌细胞在特定条件下的转录组变化。

与QPCR或Northern印迹等其他现有的基因表达研究方法相比，DNA微阵列技术的主要优势在于能够提供特定条件下所有转录组变化的全局概览。该技术快速、可靠且相对经济。实验操作将由我实验室分子遗传学方向的PSD学生Mohammed Sal和Airon Manzu进行演示。解冻spmo、ED 39细胞沉淀后，根据文本方案将其重悬于400 µL TE中，随后在无RNA酶的螺口管中配制以下组分：0.5克玻璃珠、50 µL 10% SDS、500 µL预先配制的酚-氯仿混合液，以及重悬后的细胞沉淀。

为了裂解细胞，将离心管放入珠磨机中，每次均质60秒，共进行两次，两次之间将样品置于冰上冷却一分钟，然后在4°C条件下以10,000 G离心10分钟。将上层相转移至新的离心管中，加入500微升氯仿，再离心5分钟。用移液器将上层相的500微升转移至新的离心管中。

加入两倍体积的裂解结合缓冲液，通过上下吹打混匀。然后使用RNA提取试剂盒，按照制造商的说明书操作，分离总RNA，以去除RNA中的DNA污染。加入100微升的DNase I反应混合液，在15至25摄氏度下孵育20至30分钟。

使用RN a试剂盒洗涤纯化的RNA，并将其洗脱至50微升体积中，用于在300微升PCR管中进行逆转录反应。将总RNA与2微升随机引物混合，必要时使用无核酸酶水将体积调至18微升。将逆转录反应混合物在70摄氏度孵育5分钟。

然后在室温下冷却反应物10分钟，短暂离心后将试管置于冰上至少1分钟。为进行cDNA反转录，配制反转录反应液，将18微升反转录混合液与12微升主混合液混合，于42°C孵育2至16小时。通过加入3微升2.5摩尔的NaOH降解反应中的mRNA，并在37°C放置约15分钟。

然后加入15 µL的2摩尔磷酸（无酸）以中和NaOH。随后使用PCR纯化柱纯化cDNA，并用分光光度计测定cDNA浓度以进行标记。向每微升含20至60纳克cDNA的溶液中加入5 µL的胺反应性荧光染料。

将混合物置于避光处，在室温下孵育60至90分钟，然后使用PR纯化柱进行纯化，用50微升洗脱缓冲液洗脱标记的cDNA。使用分光光度计检测，确保标记cDNA的浓度在50微升总体积中至少达到0.5皮摩尔/微升。根据文本方案配制杂交缓冲液后，将缓冲液在68摄氏度预热至少30分钟。样品制备时，等量混合标记的cDNA，然后使用高温真空浓缩仪将体积浓缩至7微升或更少。

在此期间，为清洁提升器滑片以减少背景信号，需使用肥皂和大量自来水清洗，然后在吹干提升器滑片后用100%乙醇处理。将一片滑片置于载玻片上，白色聚四氟乙烯衬面朝下。接下来，将干燥的染料样品溶解于7 µL H₂O中，在94°C孵育2分钟。立即加入35 µL预热的shy缓冲液，轻轻混匀，并以最大速度离心1分钟。

为沉淀物离心，需在上样前将探针于68摄氏度预热约五分钟。组装载玻片与盖玻片时，将杂交载玻片架置于50摄氏度的加热块上。将DNA微阵列载玻片与盖玻片一同放置在预热的杂交载玻片架上，并将载玻片与盖玻片共同预热一分钟。

然后，尽快将40微升的样本靶标加入到玻片的一端，通过毛细作用使液体在玻片表面之间流动。现在从杂交炉中取出预热的杂交盒，并关闭杂交仪。

然后将用3毫升2×SSC溶液浸湿的滤纸放入杂交盒中。轻轻将载有玻片的杂交玻片架放入杂交盒内。盖上杂交盒，放回杂交炉中，于16至18小时内孵育。

清洗玻片时，配制新鲜的洗涤缓冲液一、二和三，并将其置于 30 摄氏度。为确保 SDS 在孵育结束后充分溶解，应尽快将玻片轻轻完全浸入装有 50 毫升洗涤缓冲液一的 Falcon 管中，直至玻片沉至管底。当玻片滑落并沉至管底且未刮伤芯片表面时，用镊子取出玻片，放入洗涤站的玻片架中。

立即使用 500 毫升洗涤缓冲液一清洗载玻片 5 分钟。然后将载玻片转移至洗涤缓冲液二中孵育 20 至 30 分钟，再转移至 500 毫升洗涤缓冲液三中清洗 5 分钟。最后，在 2000 RPM 条件下离心干燥 2 分钟，随后进行微阵列分析。

根据文本方案，为研究L-丝氨酸对肺炎链球菌D39野生型菌株全转录组的影响，进行了该菌株的微阵列分析。分析比较了在化学成分明确培养基（CDM）中分别添加150微摩尔L-丝氨酸和10毫摩尔L-丝氨酸条件下培养的D39菌株。本表格列出了如图所示各培养物中分离得到的总RNA浓度。在去除DNA后，对RNA的质量进行了检测。

这两条泳道代表来自150微摩尔浓度塞纳的RNA，而这两条泳道来自在10毫摩尔浓度塞纳中培养的样品。两条清晰条带的存在表明RNA质量良好。由总RNA合成的cDNA浓度记录在此列中，而AM引物标记样品的浓度则列于此处。

本图显示了 AM 平均反应性染料比率的散点图分析，数据进一步经过分析以降低噪声。该表格总结了微阵列研究的结果，应用了差异大于或等于两倍且 P 值小于 0.001 的筛选标准。如图所示，在最低量 L-丝氨酸存在条件下，多个基因的表达水平相较于最大量条件下发生了差异性表达。此结果基于上述实验步骤得出。

在该技术开发完成后，可采用其他方法如beag、电细胞测定、QPCR、基因敲除以及表达强度分析等，以回答后续提出的问题。该技术为从事分子与细胞生物学研究的VFR研究人员提供了探索RAM阳性样本中调控网络与机制的手段。